Κυανό του μεθυλενίου και νευροδιαβιβαστές: σεροτονίνη, ντοπαμίνη, GABA και ακετυλοχολίνη

Μια συνηθισμένη διατύπωση για το κυανό του μεθυλενίου λέει ότι αυξάνει τη σεροτονίνη, αυξάνει την ντοπαμίνη, καταπραΰνει μέσω του GABA και ενισχύει την ακετυλοχολίνη, όλα ταυτόχρονα. Αυτή η διατύπωση αντιμετωπίζει τέσσερα διαφορετικά εργαστηριακά ευρήματα ως μία ενιαία επίδραση μέσα στον άνθρωπο. Οι μελέτες στις οποίες βασίζεται μέτρησαν διαφορετικούς στόχους, σε διαφορετικά παρασκευάσματα, σε συγκεντρώσεις που διαφέρουν περίπου κατά έναν συντελεστή χιλίων. Μόλις διαχωρίσουμε τους στόχους, η εικόνα γίνεται και πιο ενδιαφέρουσα και πιο επιφυλακτική απ’ όσο επιτρέπει αυτή η μία πρόταση.

Η βασική ιδέα είναι απλή. Ένα μόριο που δεσμεύεται σε ένα ένζυμο μέσα σε δοκιμαστικό σωλήνα έχει κάνει ένα πράγμα: έχει δεσμευτεί σε ένα ένζυμο μέσα σε δοκιμαστικό σωλήνα. Το αν αυτό αλλάζει το επίπεδο ενός νευροδιαβιβαστή σε έναν ζωντανό εγκέφαλο εξαρτάται από τη συγκέντρωση που φτάνει στον ιστό, από τη χημική μορφή του μορίου όταν φτάνει εκεί και από οτιδήποτε άλλο κάνει το μόριο στην ίδια συγκέντρωση. Κάθε ενότητα παρακάτω εξετάζει αυτά τα τρία ερωτήματα μαζί με το εύρημα στο οποίο αντιστοιχούν.

Σεροτονίνη: δύο στόχοι, δύο συγκεντρώσεις

Από τα τέσσερα συστήματα, η σεροτονίνη διαθέτει την ισχυρότερη τεκμηρίωση, η οποία προέρχεται από δύο διακριτούς μοριακούς στόχους που δεν πρέπει να συγχέονται.

Ο πρώτος στόχος είναι η μονοαμινοξειδάση τύπου A, το μιτοχονδριακό ένζυμο που διασπά τη σεροτονίνη. Το κυανό του μεθυλενίου αναστέλλει την καθαρισμένη ανθρώπινη MAO-A ως αναστολέας ισχυρής δέσμευσης, με Ki κοντά στα 27 nanomolar, ενώ η MAO-B χρειάζεται πολύ υψηλότερες συγκεντρώσεις για να επηρεαστεί, όπως έδειξε η κινητική μελέτη που συνέδεσε τη χρωστική με την τοξικότητα της σεροτονίνης. Μια παράλληλη ερευνητική προσέγγιση βρήκε την ίδια εκλεκτικότητα σε ιστό επίφυσης αρουραίου, όπου ο αποκλεισμός της MAO-A αύξησε τις ινδόλες που προέρχονται από τη σεροτονίνη, μείωσε τον μεταβολίτη της σεροτονίνης 5-HIAA και μεταβλήθηκε ένα αντανακλαστικό επαναφοράς της όρθιας στάσης σε βατράχους που συνδέεται με τη σεροτονίνη, όπως αναφέρεται στη μελέτη για τις οξειδοαναγωγικές χρωστικές και τις ινδόλες της επίφυσης. Δύο διαφορετικά παρασκευάσματα, ίδια κατεύθυνση: λιγότερη διάσπαση, περισσότερη σεροτονίνη παραμένει εκεί όπου το ένζυμο θα την απομάκρυνε.

Ο δεύτερος στόχος είναι ο ίδιος ο μεταφορέας σεροτονίνης. Σε κύτταρα που εκφράζουν τον ανθρώπινο μεταφορέα, το κυανό του μεθυλενίου μείωσε την πρόσληψη τόσο ενός φθορίζοντος υποστρώματος όσο και σημασμένης σεροτονίνης, με IC50 περίπου 1.4 micromolar, και κατέστειλε τα ρεύματα που προκαλούνται από τη σεροτονίνη σε καταγραφές patch-clamp, σύμφωνα με τον άμεσο χαρακτηρισμό της δράσης του κυανού του μεθυλενίου στον SERT. Οι συγγραφείς έλεγξαν τις προφανείς εναλλακτικές εξηγήσεις και διαπίστωσαν ότι η επίδραση ήταν ανεξάρτητη από τη σηματοδότηση μέσω cGMP, τις μεταβολές του ασβεστίου και την έκφραση του μεταφορέα στην κυτταρική επιφάνεια.

Προσέξτε τη διαφορά ανάμεσα στις δύο τιμές. Η αναστολή της MAO-A συμβαίνει σε νανομοριακές συγκεντρώσεις. Η αναστολή του μεταφορέα απαιτεί περίπου πενήντα φορές περισσότερη χρωστική. Μια χαμηλή έκθεση που επηρεάζει πλήρως το ένζυμο μπορεί να επηρεάζει ελάχιστα τον μεταφορέα. Όποιος συνδυάζει αυτά τα δύο σε έναν ενιαίο ισχυρισμό για τη σεροτονίνη συγχωνεύει δύο διαφορετικά εύρη δόσης σε ένα.

Το αν κάποιος από τους δύο στόχους έχει σημασία για έναν άνθρωπο που λαμβάνει άλλα σεροτονινεργικά φάρμακα είναι ζήτημα φαρμακευτικής αγωγής και ανήκει στον οδηγό αλληλεπιδράσεων φαρμάκων. Αυτό το άρθρο χαρτογραφεί τους στόχους· εκείνη η σελίδα παρέχει την κλινική καθοδήγηση.

Ντοπαμίνη: η ασθενέστερη άμεση τεκμηρίωση

Η ντοπαμίνη είναι το πεδίο όπου η ειλικρίνεια απαιτεί τη μεγαλύτερη συγκράτηση. Δεν υπάρχει καλά τεκμηριωμένη μελέτη που να δείχνει ότι το κυανό του μεθυλενίου αποκλείει τον μεταφορέα ντοπαμίνης ή δεσμεύεται απευθείας σε υποδοχείς ντοπαμίνης. Η συχνά αναφερόμενη IC50 του μεταφορέα στα 1.4 micromolar αφορά τον μεταφορέα σεροτονίνης, όχι τον DAT, και δεν πρέπει ποτέ να αποδίδεται σε άλλον στόχο.

Τα διαθέσιμα ευρήματα είναι, αντίθετα, έμμεσα. Επειδή τα ένζυμα MAO μεταβολίζουν επίσης την ντοπαμίνη, η αναστολή της MAO διατηρεί την ντοπαμίνη μαζί με τη σεροτονίνη και τη νοραδρεναλίνη. Σε μιτοχονδριακά παρασκευάσματα, το κυανό του μεθυλενίου εμπόδισε τη μετατροπή της νευροτοξίνης MPTP, μέσω της MAO-B, στην τοξική μορφή της που προσβάλλει τους ντοπαμινεργικούς νευρώνες, με ισχύ συγκρίσιμη με τη δεπρενύλη, φάρμακο για τη νόσο του Πάρκινσον, όπως περιγράφουν η μελέτη βιοενεργοποίησης του MPTP και σχετικές εργασίες για τη MAO-B. Οι μελέτες σε ζώα προσθέτουν αποσπασματικά στοιχεία: περίπου τριπλάσια βασική απελευθέρωση ντοπαμίνης από τομές ραβδωτού σώματος αρουραίου στα 10 micromolar, η οποία μελετήθηκε στο πλαίσιο της σηματοδότησης του μονοξειδίου του αζώτου και όχι ως αποκλεισμός του μεταφορέα, καθώς και μικτά αποτελέσματα ανά περιοχή μετά από συστηματική χορήγηση, με ορισμένες μελέτες να διαπιστώνουν αύξηση της σεροτονίνης και της νοραδρεναλίνης, ενώ η ντοπαμίνη μεταβαλλόταν ελάχιστα.

Επομένως, η εικόνα για την ντοπαμίνη είναι υπαρκτή αλλά έμμεση. Περνά μέσα από ένα ένζυμο που διαχειρίζεται πολλές μονοαμίνες ταυτόχρονα, όχι μέσα από έναν στόχο ειδικό για την ντοπαμίνη. Κάθε ισχυρισμός ότι το κυανό του μεθυλενίου αυξάνει την ντοπαμίνη στους ανθρώπους παρακάμπτει το βήμα στο οποίο αυτό θα έπρεπε να έχει πράγματι αποδειχθεί.

GABA: αποκλεισμός του φρένου στη θέση δέσμευσης

Το εύρημα για το GABA είναι συγκεκριμένο και έρχεται σε αντίθεση με τη φήμη της χρωστικής. Σε κύτταρα που εκφράζουν ανθρώπινους υποδοχείς GABA-A, το κυανό του μεθυλενίου ανέστειλε τα ρεύματα που προκαλούνται από το GABA, αρχίζοντας περίπου στα 3 micromolar, με IC50 κοντά στα 31 micromolar για τον συνηθισμένο συνδυασμό alpha1-beta2-gamma2, σύμφωνα με την ηλεκτροφυσιολογική μελέτη που χαρτογράφησε τη θέση δράσης.

Το σημαντικό στοιχείο είναι η χαρτογράφηση της θέσης. Οι μεταλλάξεις στη θέση της πικροτοξίνης άφησαν την αναστολή ανεπηρέαστη, ενώ οι θέσεις των βενζοδιαζεπινών και του ψευδαργύρου αποκλείστηκαν μέσω συγκρίσεων υπομονάδων. Αντίθετα, μεταλλάξεις σε δύο κατάλοιπα που είναι γνωστό ότι σχηματίζουν την ίδια τη θέση δέσμευσης του GABA μείωσαν έντονα τον αποκλεισμό. Αυτό χαρακτηρίζει τη δράση ως ανταγωνιστικό ανταγωνισμό στη θέση του αγωνιστή και όχι ως αλλοστερική τροποποίηση σε άλλη θέση. Η επίδραση διατηρήθηκε σε συνδυασμούς συναπτικών και εξωσυναπτικών υπομονάδων και υποχώρησε γρήγορα μετά την έκπλυση.

Αυτό δημιουργεί μια πραγματική αντίφαση που αξίζει να διατυπωθεί ξεκάθαρα. Ένα μόριο που διερευνάται για την υποστήριξη της μνήμης καταστέλλει επίσης την ταχεία ανασταλτική νευροδιαβίβαση σε εργαστηριακό παρασκεύασμα. Το αν αυτή η καταστολή συμβαίνει σε έναν ζωντανό εγκέφαλο εξαρτάται από την τοπική συγκέντρωση, και τα 31 micromolar είναι υψηλή τιμή σε σχέση με τις περισσότερες συστηματικές εκθέσεις, όπως εξετάζεται στην τελευταία ενότητα. Η ίδια η αντίφαση αποτελεί το εύρημα· για να επιλυθεί, θα χρειάζονταν πειράματα που δεν έχουν πραγματοποιηθεί.

Ακετυλοχολίνη: δύο στόχοι με αντίθετη δράση

Για την ακετυλοχολίνη υπάρχουν δύο ευρήματα που οδηγούν σε αντίθετες κατευθύνσεις, και αυτός ακριβώς είναι ο λόγος για τον οποίο πρέπει να παρουσιάζονται χωριστά.

Από τη μία πλευρά, το κυανό του μεθυλενίου αναστέλλει τα ένζυμα που απομακρύνουν την ακετυλοχολίνη. Η ακετυλοχολινεστεράση των ερυθροκυττάρων αγελάδας αναστάλθηκε ανταγωνιστικά περίπου στα 0.57 micromolar, το βόειο ένζυμο κοντά στα 0.42 micromolar και η δραστηριότητα εστεράσης στο ανθρώπινο πλάσμα κοντά στα 1.1 micromolar. Η βουτυρυλοχολινεστεράση αναστάλθηκε σε εύρος περίπου 0.4 έως 5.3 micromolar, ανάλογα με το είδος και το παρασκεύασμα, όπως συνοψίζεται στην ανασκόπηση των δράσεων του κυανού του μεθυλενίου στο νευρικό σύστημα. Η επιβράδυνση της απομάκρυνσης αφήνει περισσότερο νευροδιαβιβαστή στη σύναψη, η ίδια λογική στην οποία βασίζονται αρκετά εγκεκριμένα φάρμακα για τη νόσο Αλτσχάιμερ.

Η χημεία, όμως, θέτει έναν όρο. Η οξειδωμένη μπλε μορφή αναστέλλει το ένζυμο· η ανηγμένη άχρωμη μορφή δεν το αναστέλλει. Οι παρατεταμένες επωάσεις που επιτρέπουν την αναγωγή της χρωστικής καταγράφουν ασθενέστερη αναστολή μόνο και μόνο γι’ αυτόν τον λόγο. Κάθε τιμή εργαστηριακής δοκιμασίας για τη χολινεστεράση συνοδεύεται από μια αόρατη μεταβλητή: πόσο από τη χρωστική παρέμενε μπλε όταν έγινε η μέτρηση.

Από την άλλη πλευρά, το κυανό του μεθυλενίου αποκλείει τον νικοτινικό υποδοχέα alpha7, έναν από τους υποδοχείς στους οποίους δρα η ακετυλοχολίνη. Ανθρώπινοι υποδοχείς alpha7 που εκφράστηκαν σε ωοκύτταρα βατράχου αναστάλθηκαν με IC50 κοντά στα 3.4 micromolar, μέσω μη ανταγωνιστικού ανταγωνισμού ανεξάρτητου από το δυναμικό της μεμβράνης, χωρίς μεταβολή της ισχύος του αγωνιστή. Επίσης, τα 3 micromolar εξάλειψαν τις συναπτικές αποκρίσεις που προκαλούνται από τη χολίνη σε τομές ιππόκαμπου αρουραίου, όπως αναφέρει η μελέτη του υποδοχέα alpha7. Επομένως, σε παρόμοιες χαμηλές μικρομοριακές συγκεντρώσεις, η χρωστική διατηρεί τον νευροδιαβιβαστή και ταυτόχρονα εξασθενεί τη λειτουργία ενός από τους υποδοχείς του. Η συνολική επίδραση στη χολινεργική σηματοδότηση δεν μπορεί να συναχθεί από κανένα από τα δύο ευρήματα μεμονωμένα. Αυτή η αμφισημία συνδέεται με την ευρύτερη βιβλιογραφία για τη νόσο Αλτσχάιμερ και με τη σχετική συζήτηση για την έρευνα της γνωστικής λειτουργίας και των ασθενειών, χωρίς να επιλύεται εδώ.

Η σύγκριση, συγκεντρωμένη σε ένα σημείο

Τρεις τάξεις μεγέθους χωρίζουν τον πιο ευαίσθητο στόχο από τον λιγότερο ευαίσθητο. Αυτή η διαφορά συνοψίζει το άρθρο σε έναν πίνακα.

Φτάνουν αυτές οι συγκεντρώσεις στον εγκέφαλο;

Μια τιμή από δοκιμαστικό σωλήνα δεν σημαίνει τίποτα χωρίς μια τιμή έκθεσης δίπλα της. Μετά από εφάπαξ ταχεία ενδοφλέβια χορήγηση κοντά στα 1.4 mg ανά kg, έχουν αναφερθεί μέσες συγκεντρώσεις στο ανθρώπινο πλάσμα περίπου 5 micromolar, ενώ μια από του στόματος δόση 100 mg παρήγαγε συγκεντρώσεις στο ολικό αίμα κοντά στα 0.08 micromolar, σύμφωνα με την ίδια σειρά βιβλιογραφικών αναφορών. Μελέτες κατανομής σε αρουραίους βρίσκουν συγκεντρώσεις στον εγκέφαλο περίπου δέκα έως είκοσι φορές υψηλότερες από τις κυκλοφορούσες. Ωστόσο, αυτό αφορά τη συνολική χρωστική σε ομογενοποιημένο ιστό, όχι την ελεύθερη οξειδωμένη χρωστική σε μια σύναψη, ενώ η δέσμευση σε πρωτεΐνες του πλάσματος κοντά στο 94 τοις εκατό και η κατανομή στα κύτταρα του αίματος μειώνουν ακόμη περισσότερο το ελεύθερο κλάσμα.

Σε συνδυασμό με τον πίνακα, η εικόνα είναι διαβαθμισμένη και όχι δυαδική. Η αναστολή της MAO-A εμφανίζεται πολύ κάτω από τις τυπικές ενδοφλέβιες εκθέσεις και είναι φαρμακολογικά εύλογη όταν η χρωστική χορηγείται με αυτόν τον τρόπο. Οι επιδράσεις στη χολινεστεράση και στον alpha7 βρίσκονται στο χαμηλό μικρομοριακό εύρος, με το οποίο συμπίπτουν οι κορυφαίες ενδοφλέβιες συγκεντρώσεις, αλλά στο οποίο οι συνήθεις από του στόματος δόσεις ενδέχεται να μη φτάνουν. Η IC50 του GABA-A στα 31 micromolar βρίσκεται πάνω από τις περισσότερες εύλογες συστηματικές εκθέσεις, γεγονός που καθιστά αυτόν τον συγκεκριμένο αποκλεισμό τον δυσκολότερο να υποστηριχθεί σε έναν ολόκληρο ανθρώπινο οργανισμό. Κάθε γραμμή αυτής της σύγκρισης χρειάζεται την ίδια επιφύλαξη: η σχετική συγκέντρωση είναι εκείνη της ελεύθερης, οξειδωμένης, εξωκυττάριας χρωστικής στον στόχο, μια ποσότητα που καμία αιμοληψία δεν μετρά άμεσα.

Ποια συμπεράσματα δεν πρέπει να εξαχθούν

Καμία γραμμή του πίνακα δεν αποδεικνύει ότι το κυανό του μεθυλενίου αυξάνει ή μειώνει προβλέψιμα οποιονδήποτε νευροδιαβιβαστή σε έναν άνθρωπο. Η αναστολή ενζύμου σε καθαρισμένο παρασκεύασμα, ο αποκλεισμός μεταφορέα σε κυτταρική σειρά και ο ανταγωνισμός υποδοχέα σε τομή ιστού απέχουν, το καθένα, ένα ελεγχόμενο πειραματικό βήμα από τη συναπτική πραγματικότητα. Η ενότητα για τη χολινεργική σηματοδότηση δείχνει επίσης δύο πραγματικά ευρήματα που αλληλοαναιρούνται, αφήνοντας αβεβαιότητα. Η υπεύθυνη χρήση αυτής της σελίδας είναι ως χάρτη των στόχων με τους οποίους έχει αποδειχθεί ότι αλληλεπιδρά το μόριο, με καταγεγραμμένη την ισχύ κάθε αλληλεπίδρασης, ώστε η συζήτηση για τους μηχανισμούς να παραμένει συνδεδεμένη με όσα πράγματι μετρήθηκαν. Για το πώς αυτές οι αλληλεπιδράσεις συνδυάζονται με συνταγογραφούμενα φάρμακα, ο οδηγός αλληλεπιδράσεων είναι η σελίδα που αναλαμβάνει αυτόν τον ρόλο, μαζί με πρόσθετο πλαίσιο στις βασικές αρχές της φαρμακολογίας και στο συνοδευτικό επεξηγηματικό άρθρο για τους μηχανισμούς.