Κυανό του μεθυλενίου και μονοξείδιο του αζώτου: NOS, cGMP και αγγειακή σηματοδότηση

Το ερώτημα ακούγεται απλό: αναστέλλει το κυανό του μεθυλενίου το μονοξείδιο του αζώτου; Στο εργαστήριο, η απάντηση χωρίζεται σε τέσσερα ξεχωριστά ερωτήματα, καθένα από τα οποία απαιτεί διαφορετικό πειραματικό έλεγχο. Η σύγχυση μεταξύ τους είναι ο κύριος λόγος για τον οποίο τα κείμενα για το κυανό του μεθυλενίου και το μονοξείδιο του αζώτου μοιάζουν βέβαια αλλά παραμένουν ασαφή.

Σκεφτείτε το σήμα του μονοξειδίου του αζώτου ως μια αλυσίδα με τέσσερις κρίκους. Ένα γονίδιο μεταγράφεται για να παραχθεί συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου. Το ένζυμο μετατρέπει την αργινίνη σε μονοξείδιο του αζώτου. Το αέριο διαχέεται προς τον στόχο του προτού αντιδράσει με κάτι άλλο. Η διαλυτή γουανυλική κυκλάση το ανιχνεύει και παράγει κυκλική GMP. Έχουν δημοσιευτεί επιδράσεις του κυανού του μεθυλενίου σε κάθε κρίκο, αλλά τα δεδομένα προέρχονται από διαφορετικά παρασκευάσματα, διαφορετικές συγκεντρώσεις και διαφορετικές ισομορφές. Ένα αποτέλεσμα σε έναν κρίκο δεν αποδεικνύει δράση σε κάποιον άλλο.

Η καθιερωμένη αλυσίδα, με απλά λόγια

Στο τοίχωμα ενός αιμοφόρου αγγείου, η τυπική αλληλουχία έχει ως εξής. Ένα ερέθισμα δρα σε ένα ενδοθηλιακό κύτταρο. Η ενδοθηλιακή συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου, που ονομάζεται eNOS ή NOS3, παράγει έναν μικρό παλμό μονοξειδίου του αζώτου. Το αέριο διαχέεται στο γειτονικό λείο μυϊκό κύτταρο, προσδένεται στην αίμη με ανηγμένο σίδηρο της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης και επιταχύνει τη μετατροπή της GTP σε κυκλική GMP. Η κυκλική GMP ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση G, η ρύθμιση του ασβεστίου μεταβάλλεται και ο μυς χαλαρώνει.

Υπάρχει και μια δεύτερη αλυσίδα που αξίζει να εξετάζεται χωριστά. Κατά τη διάρκεια λοίμωξης ή έκθεσης σε κυτταροκίνες, τα κύτταρα μεταγράφουν το γονίδιο ενός διαφορετικού ενζύμου, της επαγώγιμης συνθάσης του μονοξειδίου του αζώτου ή iNOS, που ονομάζεται επίσης NOS2. Αυτή παράγει μεγαλύτερες και πιο παρατεταμένες ροές μονοξειδίου του αζώτου από την eNOS. Μια τρίτη ισομορφή, η νευρωνική NOS ή nNOS, ανήκει σε ένα ακόμη διαφορετικό πλαίσιο. Όταν μια δημοσίευση αναφέρει τη συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου χωρίς να προσδιορίζει την ισομορφή, σταματήστε και ελέγξτε ποια μετρήθηκε. Η επισκόπηση του τρόπου με τον οποίο το κυανό του μεθυλενίου μεταφέρει ηλεκτρόνια επισημαίνει το ίδιο για τους οξειδοαναγωγικούς στόχους γενικά: ο ενδιάμεσος φορέας δεν δρα μόνος του και ο εταίρος σε κάθε άκρο καθορίζει το αποτέλεσμα.

Η μετρούμενη κυκλική GMP είναι επίσης ένας συνολικός δείκτης, όχι μια άμεση δοκιμασία ενζυμικής δραστικότητας. Το επίπεδό της αντανακλά τη σύνθεση από την κυκλάση μείον την αποδόμηση από τις φωσφοδιεστεράσες, ιδίως την PDE5 στον αγγειακό λείο μυ. Επομένως, μια πτώση της κυκλικής GMP σημαίνει ότι λιγότερο σήμα έφτασε στον ανιχνευτή. Δεν προσδιορίζει από μόνη της ποιος κρίκος απέτυχε.

Κρίκος 1: παράγεται λιγότερο ένζυμο iNOS

Σε μακροφάγα ποντικού που διεγέρθηκαν με βακτηριακό λιποπολυσακχαρίτη, ιντερφερόνη γάμμα ή και τα δύο, το κυανό του μεθυλενίου απέτρεψε την αναμενόμενη αύξηση της πρωτεΐνης iNOS και κατέστειλε έντονα το αγγελιαφόρο RNA της iNOS στα πειράματα μεταγραφής σε μακροφάγα. Το κατατοπιστικό στοιχείο είναι τι δεν άλλαξε. Η αποδόμηση του αναστολέα I κάππα B άλφα, η φωσφορυλίωση των NF κάππα B και STAT1 και η μετακίνηση αυτών των παραγόντων στον πυρήνα παρέμειναν σε μεγάλο βαθμό ανεπηρέαστες. Αυτό που μειώθηκε ήταν η πρόσδεσή τους στο DNA, όπως επιβεβαιώθηκε με ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης που έδειξε μειωμένη κατάληψη του υποκινητή της iNOS.

Πρόκειται για επίδραση στη γονιδιακή ρύθμιση, πριν από τη διαμόρφωση της ποσότητας του ενζύμου, όχι για οξύ αποκλεισμό ενός ήδη υπάρχοντος ενζύμου. Ανήκει στη φλεγμονώδη σηματοδότηση, όπου οι μεταγραφικοί παράγοντες πρέπει να προσδεθούν σε έναν υποκινητή προτού εμφανιστεί η πρωτεΐνη. Δεν λέει κάτι άμεσα για τη συστατικά εκφραζόμενη eNOS σε ένα αγγείο σε ηρεμία και πρέπει να περιγράφεται με αυτούς τους όρους.

Κρίκος 2: το υπάρχον ένζυμο NOS λειτουργεί πιο αργά

Μια μελέτη σε αρουραίους εξέτασε διαφορετικό επίπεδο. Αρσενικοί αρουραίοι σε εγρήγορση έλαβαν λιποπολυσακχαρίτη ενδοφλεβίως και, τρεις ώρες αργότερα, έλαβαν είτε φυσιολογικό ορό είτε κυανό του μεθυλενίου σε δόση 3 mg ανά kg ενδοφλεβίως. Η δραστικότητα της συνθάσης του μονοξειδίου του αζώτου στον μεσοβασικό υποθάλαμο μετρήθηκε μέσω της μετατροπής σημασμένης αργινίνης σε κιτρουλλίνη στη μελέτη της δραστικότητας της υποθαλαμικής NOS. Το στρες μαζί με τον φυσιολογικό ορό, χωρίς λιποπολυσακχαρίτη, προκάλεσε κάποια ανεξάρτητη από το ασβέστιο δραστικότητα, και ο λιποπολυσακχαρίτης την αύξησε περίπου στο δεκαπλάσιο του επιπέδου της ομάδας ελέγχου. Το κυανό του μεθυλενίου εξάλειψε και τις δύο επαγόμενες συνιστώσες. Η εξαρτώμενη από το ασβέστιο, συστατική δραστικότητα δεν άλλαξε στον συγκεκριμένο ιστό, σε εκείνη τη δόση και χρονική στιγμή.

Διαβάστε αυτό το αποτέλεσμα ακριβώς όπως διατυπώνεται: καταστολή της μετρούμενης δραστικότητας τύπου iNOS υπό τις συγκεκριμένες συνθήκες. Δεν είναι μέτρηση γονιδιακής έκφρασης ούτε απόδειξη σταθερής εκλεκτικότητας για την iNOS έναντι της eNOS ή της nNOS. Οι μελέτες με καθαρισμένα ένζυμα ενισχύουν την ανάγκη προσοχής. Σε άμεσες δοκιμασίες καθαρισμένης συνθάσης του μονοξειδίου του αζώτου, το κυανό του μεθυλενίου απέκλεισε πλήρως τον σχηματισμό κιτρουλλίνης σε συγκέντρωση 30 micromolar, με συγκέντρωση ημιμέγιστης αναστολής κοντά στα 5.3 micromolar χωρίς δισμουτάση του υπεροξειδίου και στα 9.2 micromolar παρουσία της, όπως αναφέρεται στη σύγκριση καθαρισμένης NOS και γουανυλικής κυκλάσης. Μια ξεχωριστή μελέτη καθαρισμένης nNOS υπέδειξε εμπλοκή της οξείδωσης της αίμης που είναι συνδεδεμένη με το ένζυμο. Το πρακτικό συμπέρασμα είναι ότι η άμεση αναστολή της NOS είναι πραγματική σε απομονωμένα συστήματα, αλλά το υποθαλαμικό αποτέλεσμα δεν μπορεί να επεκταθεί σε έναν γενικό ισχυρισμό ότι το κυανό του μεθυλενίου αφήνει ανεπηρέαστες όλες τις συστατικές NOS παντού.

Κρίκος 3: το μονοξείδιο του αζώτου χάνεται προτού φτάσει

Η σαφέστερη απόδειξη ότι κάτι διαφορετικό από τον αποκλεισμό ενζύμου μπορεί να εξηγήσει μια πτώση της κυκλικής GMP προέρχεται από καλλιεργημένα λεία μυϊκά κύτταρα πνευμονικής αρτηρίας κουνελιού. Ο πειραματικός σχεδιασμός παρέκαμψε πλήρως την ενδογενή NOS προσθέτοντας απευθείας δότες μονοξειδίου του αζώτου και στη συνέχεια εξέτασε αν το κυανό του μεθυλενίου εξακολουθούσε να καταστέλλει την απόκριση της κυκλικής GMP στη μελέτη του υπεροξειδίου στον αγγειακό λείο μυ.

Δοκιμάστηκαν τρεις δότες σε συγκεντρώσεις από 1 έως 100 micromolar: S-νιτροζο-L-κυστεΐνη, νιτροπρωσσικό νάτριο και ένα σταθερό απαμινωμένο ανάλογο που ονομάζεται MPANO. Όλοι αύξησαν την κυκλική GMP περίπου κατά 1.5 έως 12 φορές. Το κυανό του μεθυλενίου σε συγκέντρωση 10 micromolar ανέστειλε τους δύο πρώτους κατά 51 έως 100 τοις εκατό και άφησε την απόκριση στο MPANO αμετάβλητη. Αν το κυανό του μεθυλενίου απέκλειε απλώς το καταλυτικό κέντρο της κυκλάσης, αυτή η εκλεκτικότητα ως προς τον δότη θα ήταν δύσκολο να εξηγηθεί, επειδή και οι τρεις συγκλίνουν στο ίδιο ένζυμο σε επόμενο στάδιο της οδού.

Τρεις έλεγχοι συνέδεσαν στη συνέχεια τον μηχανισμό με το υπεροξείδιο. Πρώτον, η παραγωγή εξωκυττάριου υπεροξειδίου με ξανθίνη και οξειδάση της ξανθίνης αναπαρήγαγε το ίδιο μοτίβο: αποκλεισμός της CYSNO και του νιτροπρωσσικού, χωρίς επίδραση στο MPANO. Δεύτερον, το κυανό του μεθυλενίου προκάλεσε παραγωγή υπεροξειδίου από τα λεία μυϊκά κύτταρα, εξαρτώμενη από τη δόση και τον χρόνο, η οποία μετρήθηκε μέσω της αναγωγής του κυτοχρώματος c. Τρίτον, η δισμουτάση του υπεροξειδίου απέτρεψε πλήρως την αναστολή, ενώ η καταλάση όχι, γεγονός που υποδεικνύει το υπεροξείδιο και όχι το υπεροξείδιο του υδρογόνου ως το άμεσα υπεύθυνο χημικό είδος στο συγκεκριμένο παρασκεύασμα.

Αξίζει να περιγραφεί η εκδοχή του πειράματος με συγκαλλιέργεια, επειδή εντοπίζει χωρικά την επίδραση. Ενδοθηλιακά κύτταρα πάνω σε καλυπτρίδες συγκαλλιεργήθηκαν για λίγο με λεία μυϊκά κύτταρα, με αποτέλεσμα ο ενδοθηλιακός παράγοντας που απελευθερωνόταν σε βασικές συνθήκες να αυξήσει την κυκλική GMP των λείων μυϊκών κυττάρων κατά τρεις έως οκτώ φορές. Η προεπεξεργασία οποιουδήποτε από τα δύο διαμερίσματα με κυανό του μεθυλενίου μείωσε αυτό το σήμα, και η δισμουτάση του υπεροξειδίου αντέστρεψε εν μέρει την επίδραση της προεπεξεργασίας του ενδοθηλίου. Με άλλα λόγια, το κυανό του μεθυλενίου δεν χρειάζεται καν να δρα μέσα στο λείο μυϊκό κύτταρο που ανιχνεύει το σήμα. Μπορεί να μειώσει το σήμα απομακρύνοντας τον αγγελιαφόρο κατά τη μεταφορά του. Ο οδηγός ανάγνωσης της έρευνας για το κυανό του μεθυλενίου αντιμετωπίζει αυτό ως γενικό κανόνα: προσδιορίστε το διαμέρισμα όπου έγινε η παρέμβαση προτού προσδιορίσετε έναν μοριακό στόχο.

Θα ήταν λάθος να ονομάσουμε αυτό αναστολή της NOS. Για να δράσουν οι δότες δεν απαιτούνταν κανένα βήμα συνθάσης, κι όμως το σήμα μειώθηκε.

Κρίκος 4: ο ίδιος ο ανιχνευτής ανταποκρίνεται λιγότερο

Υπάρχουν άμεσες επιδράσεις στη διαλυτή γουανυλική κυκλάση, αλλά οι συγκεντρώσεις έχουν σημασία. Στη σύγκριση καθαρισμένων ενζύμων που αναφέρθηκε παραπάνω, η κυκλάση που διεγειρόταν από το μονοξείδιο του αζώτου χρειαζόταν κυανό του μεθυλενίου σε συγκέντρωση περίπου 60 micromolar για ημιμέγιστη αναστολή, έναντι περίπου 5 έως 9 micromolar για ημιμέγιστη αναστολή της NOS, ενώ ακόμη και συγκέντρωση 1 millimolar επέφερε μόνο μερικό αποκλεισμό στη μέγιστη απόκριση. Πρόκειται για διαφορά περίπου έξι έως έντεκα φορές. Επομένως, ένα κυτταρικό πείραμα σε χαμηλές μικρομοριακές συγκεντρώσεις που μειώνει την κυκλική GMP δεν μπορεί να χαρακτηριστεί εκλεκτική αναστολή της κυκλάσης μόνο βάσει της τιμής της κυκλικής GMP.

Μια μεταγενέστερη οξειδοαναγωγική μελέτη πρόσθεσε μια δεύτερη επιφύλαξη: το κυανό του μεθυλενίου απενεργοποίησε την κυκλάση που είχε ενεργοποιηθεί από το μονοξείδιο του αζώτου μέσω μηχανισμού διαφορετικού από την απλή οξείδωση του σιδήρου της αίμης από τον αέρα. Συνεπώς, ο ανιχνευτής μπορεί να επηρεαστεί, αλλά η χημεία δεν έχει αποσαφηνιστεί, και η διαφορά στις συγκεντρώσεις σημαίνει ότι, σε εκθέσεις σε χαμηλές μικρομοριακές συγκεντρώσεις, πρέπει πρώτα να αποκλειστούν οι επιδράσεις του υπεροξειδίου και της NOS. Εδώ εντάσσεται επίσης ο έλεγχος των φωσφοδιεστερασών. Αν η αποδόμηση δεν μετρήθηκε ή δεν αποκλείστηκε, η μειωμένη συσσώρευση κυκλικής GMP είναι συμβατή με λιγότερη σύνθεση, ταχύτερη αποδόμηση ή και τα δύο.

Γιατί αυτό δεν ανάγεται σε έναν μόνο ισχυρισμό για την αρτηριακή πίεση

Κάθε κρίκος τεκμηριώθηκε σε διαφορετικό σύστημα. Η μεταγραφή στα μακροφάγα δεν είναι η ενζυμική δραστικότητα στον υποθάλαμο. Η υποθαλαμική δραστικότητα μετά από λιποπολυσακχαρίτη δεν είναι ο ενδοθηλιακός τόνος σε ηρεμία. Ο ενδοθηλιακός παράγοντας που απελευθερώνεται σε βασικές συνθήκες σε συγκαλλιέργεια δεν είναι η αγγειοδιαστολή που διεγείρεται από αγωνιστή. Τα καλλιεργημένα κύτταρα πνευμονικής αρτηρίας σε κυανό του μεθυλενίου συγκέντρωσης 10 micromolar δεν είναι η ανθρώπινη κυκλοφορία. Η συμπύκνωση όλων αυτών σε μια διατύπωση όπως «το κυανό του μεθυλενίου αυξάνει την αρτηριακή πίεση αποκλείοντας το μονοξείδιο του αζώτου» απορρίπτει ακριβώς τις διακρίσεις που οι πειραματικοί έλεγχοι σχεδιάστηκαν για να διατηρήσουν.

Τρεις έλεγχοι διατηρούν την ερμηνεία ακριβή. Πρώτον, προσδιορίστε την ισομορφή: eNOS για τον αγγειακό τόνο σε ηρεμία, iNOS για την επαγόμενη φλεγμονώδη ροή, nNOS για νευρωνικά συστήματα και ορισμένα πειράματα με καθαρισμένα ένζυμα. Δεύτερον, προσδιορίστε πώς παρέχεται το σήμα του μονοξειδίου του αζώτου: ενδογενής σύνθεση, βασική ενδοθηλιακή απελευθέρωση ή συγκεκριμένος δότης όπως η CYSNO, το νιτροπρωσσικό ή το MPANO, αφού ο σταθερός δότης αντιστάθηκε στο κυανό του μεθυλενίου, ενώ οι ασταθείς όχι. Τρίτον, προσδιορίστε τη συγκέντρωση και την αποκατάσταση: η αποκατάσταση με δισμουτάση του υπεροξειδίου υποδεικνύει εμπλοκή του υπεροξειδίου, η αποτυχία της καταλάσης συνηγορεί κατά του υπεροξειδίου του υδρογόνου στο συγκεκριμένο παρασκεύασμα, η αναπαραγωγή της επίδρασης με οξειδάση της ξανθίνης δείχνει ότι ο μηχανισμός επαρκεί, και οι δοκιμασίες καθαρισμένων ενζύμων διαχωρίζουν τις άμεσες επιδράσεις στην κατάλυση από τις απώλειες κατά τη μεταφορά.

Η συνοπτική σύνθεση είναι η εξής. Το κυανό του μεθυλενίου είναι προτιμότερο να αντιμετωπίζεται ως παράγοντας που διαταράσσει σε πολλαπλά σημεία τη σηματοδότηση από το μονοξείδιο του αζώτου προς την κυκλική GMP, παρά ως εκλεκτικός αναστολέας της κυκλάσης. Ανάλογα με το παρασκεύασμα και τη συγκέντρωση, μπορεί να μειώσει την πρόσδεση μεταγραφικών παραγόντων της iNOS, να αναστείλει άμεσα τα ένζυμα NOS, να μειώσει τη διαθεσιμότητα του μονοξειδίου του αζώτου μέσω της παραγωγής υπεροξειδίου και να επηρεάσει την κυκλάση που ενεργοποιείται από το μονοξείδιο του αζώτου. Ο ρόλος της σηματοδότησης της κυκλικής GMP στις αγγειακές μελέτες και η σύγκριση των δοτών μονοξειδίου του αζώτου που χρησιμοποιούνται σε κυτταρικές δοκιμασίες καλύπτουν ο καθένας έναν από αυτούς τους κλάδους με περισσότερες λεπτομέρειες, ενώ οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον διαχωρισμό των οξειδοαναγωγικών επιδράσεων από τις ενζυμικές επιδράσεις εξηγούν γιατί ο συνδυασμός δισμουτάσης του υπεροξειδίου, καταλάσης και ελέγχου με σταθερό δότη εμφανίζεται τόσο συχνά σε αυτή τη βιβλιογραφία.

Μια χαμηλή τιμή κυκλικής GMP μετά από κυανό του μεθυλενίου υποδεικνύει μια σπασμένη αλυσίδα. Μόνο οι πειραματικοί έλεγχοι δείχνουν ποιος κρίκος έσπασε.