Κυανό του μεθυλενίου και έκθεση στο φως: μήκος κύματος, πυκνότητα ισχύος και γεωμετρία εφαρμογής

Δύο δημοσιεύσεις αναφέρουν έκθεση του κυανού του μεθυλενίου σε 10 J φωτός ανά τετραγωνικό cm. Η μία σκοτώνει βακτήρια. Η άλλη δεν προκαλεί κανένα μετρήσιμο αποτέλεσμα. Ένας αναγνώστης που συγκρίνει μόνο τη δόση συμπεραίνει ότι το πεδίο παρουσιάζει ασυνέπεια. Το πεδίο είναι συνεπές. Η δόση δεν περιέγραφε ποτέ ολόκληρη την έκθεση.

Η έκθεση στο φως είναι ένα μικρό σύστημα παραμέτρων που δρουν μαζί: μήκος κύματος, πυκνότητα ισχύος ακτινοβολίας, διάρκεια, η προκύπτουσα ενεργειακή πυκνότητα, διαθεσιμότητα οξυγόνου, συγκέντρωση και κατάσταση συσσωμάτωσης της χρωστικής, το χρονικό διάστημα μεταξύ χρωστικής και φωτός και η οπτική διαδρομή που πράγματι διανύει το φως μέσα στο δείγμα. Αλλάξτε μία από αυτές και η φωτοχημεία αλλάζει. Αυτό το άρθρο εξετάζει κάθε παράμετρο και στη συνέχεια διακρίνει τη φωτοβιοτροποποίηση με εγγύς υπέρυθρο φως από την άμεση φωτοενεργοποίηση της χρωστικής, επειδή αυτές οι δύο συνθήκες συγχέονται συχνότερα.

Το μήκος κύματος καθορίζει αν η χρωστική συμμετέχει

Το κυανό του μεθυλενίου στο νερό απορροφά έντονα το ερυθρό φως ως μονομερές, με κορυφή κοντά στα 664 έως 665 nm και έναν ώμο σε μικρότερο μήκος κύματος, κοντά στα 610 nm, ο οποίος ενισχύεται καθώς η χρωστική συσσωματώνεται σε διμερή και μεγαλύτερες στοίβες μορίων. Ο μοριακός συντελεστής απόσβεσης κοντά στην κορυφή είναι της τάξης των 65,000 έως 85,000 M-1 cm-1, επομένως ακόμη και διαλύματα μικρομοριακής συγκέντρωσης έχουν έντονο μπλε χρώμα. Η πρώιμη φωτοχημική ανασκόπηση του κυανού του μεθυλενίου με DNA και βιολογικά υποστρώματα τεκμηριώνει αυτή τη συμπεριφορά απορρόφησης και τη χημεία των διεγερμένων καταστάσεων που ακολουθεί: η απορρόφηση οδηγεί σε μια βραχύβια μονήρη κατάσταση και κατόπιν σε μια πιο μακρόβια τριπλή κατάσταση, με αναφερόμενες αποδόσεις κοντά στο 0.5, η οποία σε αεριζόμενο διάλυμα αποσβένεται από το οξυγόνο μέσα σε περίπου 2 μικροδευτερόλεπτα.

Αυτό το βήμα απόσβεσης είναι το σημείο όπου οι δύο φωτοχημικές οδοί αποκλίνουν. Στη χημεία Τύπου II, η χρωστική στην τριπλή κατάσταση μεταφέρει ενέργεια στο οξυγόνο της θεμελιώδους κατάστασης και παράγει μονήρες οξυγόνο, με συχνά αναφερόμενες αποδόσεις κοντά στο 0.52. Στη χημεία Τύπου I, η τριπλή κατάσταση μεταφέρει αντ’ αυτού ένα ηλεκτρόνιο ή υδρογόνο σε ένα υπόστρωμα, παράγοντας ρίζες, μεταξύ των οποίων υπεροξείδιο και ρίζες υδροξυλίου. Και οι δύο οδοί μπορούν να λειτουργούν ταυτόχρονα, ενώ το συμβατικό φωτοδυναμικό αποτέλεσμα παραμένει έντονα εξαρτώμενο από το οξυγόνο, ακόμη και όταν συμβάλλει ο Τύπος I.

Η συνέπεια για την επιλογή μήκους κύματος του κυανού του μεθυλενίου είναι ένας απλός κανόνας. Το ερυθρό φως από περίπου 630 έως 680 nm επικαλύπτει τη ζώνη απορρόφησης της χρωστικής, με τα 660 έως 665 nm κοντά στο μέγιστο του μονομερούς, επομένως μπορεί να πυροδοτήσει φωτοχημικές αντιδράσεις μέσω του φωτοευαισθητοποιητή όπου υπάρχει σημαντική ποσότητα χρωστικής. Το εγγύς υπέρυθρο στα 810 nm βρίσκεται πολύ έξω από τη ζώνη απορρόφησης της θεμελιώδους κατάστασης, επομένως δεν είναι κατάλληλο μήκος κύματος για άμεση διέγερση της χρωστικής. Η συγκέντρωση περιπλέκει την εικόνα με έναν σαφή τρόπο: καθώς αυξάνεται, μεγαλύτερο μέρος της χρωστικής βρίσκεται σε διμερείς και συσσωματωμένες μορφές που απορροφούν προς τα 610 nm και προκαλούν φωτοευαισθητοποίηση λιγότερο αποτελεσματικά ανά μόριο, επομένως ο διπλασιασμός της χρωστικής δεν διπλασιάζει το αποτέλεσμα. Η συνοδευτική ανασκόπηση για το κυανό του μεθυλενίου και τη θεραπεία με ερυθρό φως αντιμετωπίζει αυτόν τον κανόνα απορρόφησης ως προϋπόθεση για οποιαδήποτε φωτοευαισθητοποιημένη αντίδραση.

Η πυκνότητα ισχύος, η διάρκεια και η ενεργειακή πυκνότητα είναι τρεις παράμετροι, όχι μία

Η ενεργειακή πυκνότητα, σε J ανά τετραγωνικό cm, είναι η πυκνότητα ισχύος ακτινοβολίας πολλαπλασιασμένη επί τον χρόνο. Η αναφορά μόνο της ενεργειακής πυκνότητας αποκρύπτει τον ρυθμό με τον οποίο έφτασε η ενέργεια, και αυτός ο ρυθμός έχει σημασία.

Μια υψηλή πυκνότητα ισχύος που εφαρμόζεται για λίγο και μια χαμηλή πυκνότητα ισχύος που εφαρμόζεται για μεγάλο διάστημα μπορούν να δώσουν την ίδια ενεργειακή πυκνότητα με διαφορετική χημεία. Η υψηλή πυκνότητα ισχύος καταναλώνει το διαλυμένο οξυγόνο ταχύτερα από όσο το αναπληρώνει η διάχυση, περιορίζοντας την εξαρτώμενη από το οξυγόνο οδό Τύπου II κατά τη διάρκεια της έκθεσης. Επίσης εναποθέτει θερμότητα, και ο ιστός ανταποκρίνεται στη θέρμανση με αλλαγές στην αιματική ροή που μεταβάλλουν τόσο την οξυγόνωση όσο και την κατανομή της χρωστικής. Η χαμηλή πυκνότητα ισχύος σε μια παρατεταμένη έκθεση διατηρεί την παροχή οξυγόνου, αλλά δίνει στις διεργασίες επιδιόρθωσης και επανοξυγόνωσης χρόνο να δράσουν κατά την ίδια την έκθεση. Τα εγχειρίδια φωτοχημείας ονομάζουν αμοιβαιότητα την υπόθεση ότι σημασία έχει μόνο η συνολική δόση. Αυτή δεν ισχύει όταν συμμετέχουν το οξυγόνο, η θέρμανση ή βιολογικές διεργασίες, κάτι που στους ιστούς συμβαίνει σχεδόν πάντα.

Οι αντιμικροβιακές φωτοδυναμικές εκθέσεις με κυανό του μεθυλενίου σε ανθρώπους χρησιμοποιούν συνήθως 6 έως 18 J ανά τετραγωνικό cm, εύρος που επικαλύπτεται με τις τιμές της φωτοβιοτροποποίησης. Επομένως, η ενεργειακή πυκνότητα από μόνη της δεν μπορεί να προσδιορίσει τον τύπο της εφαρμογής. Μια έκθεση 10 J ανά τετραγωνικό cm στα 660 nm σε ιστό που περιέχει χρωστική είναι φωτοχημεία μέσω φωτοευαισθητοποιητή. Η ίδια ενεργειακή πυκνότητα στα 810 nm σε ιστό με ίχνη χρωστικής είναι κάτι εντελώς διαφορετικό. Ο αριθμός είναι ίδιος. Η έννοια διαφέρει.

Η οπτική διαδρομή και η γεωμετρία του δείγματος καθορίζουν τι συναντά το φως

Η συμπεριφορά σύμφωνα με τον νόμο Beer Lambert σημαίνει ότι το μπροστινό μέρος ενός δείγματος δέχεται πολύ περισσότερο φως από το πίσω. Σε μια κυψελίδα με χρωστική σε συγκέντρωση δεκάδων μικρομορίων ανά λίτρο, το πρώτο χιλιοστό μπορεί να απορροφήσει το μεγαλύτερο μέρος του προσπίπτοντος ερυθρού φωτός, αφήνοντας τα βαθύτερα στρώματα ουσιαστικά χωρίς έκθεση. Αν το ίδιο διάλυμα τοποθετηθεί σε ένα ρηχό φρεάτιο με μικρό όγκο, η έκθεση γίνεται σχεδόν ομοιόμορφη. Ίδια χρωστική, ίδια λυχνία, ίδια ενεργειακή πυκνότητα στην επιφάνεια, διαφορετικό αποτέλεσμα.

Ο ιστός προσθέτει σκέδαση πέρα από την απορρόφηση. Το ερυθρό φως κοντά στα 660 nm διεισδύει σε βάθος της τάξης των χιλιοστών, με το ακριβές βάθος να καθορίζεται από την περιεκτικότητα σε αίμα, τη μελάγχρωση και τον τύπο ιστού. Τα φρεάτια προσθέτουν τα δικά τους τεχνουργήματα: δράση του μηνίσκου ως φακού, ανάκλαση από τα τοιχώματα, σκίαση των περιφερειακών φρεατίων και θέρμανση μικρών όγκων κάτω από την πηγή. Δύο εργαστήρια που αναφέρουν ίδιες ρυθμίσεις λυχνίας αλλά διαφορετικούς τύπους πλακών, όγκους ή αποστάσεις πηγής έχουν πραγματοποιήσει διαφορετικά πειράματα.

Η απόσταση αξίζει ιδιαίτερη έμφαση, επειδή είναι η συνηθέστερη μεταβλητή που μένει αδήλωτη. Η πυκνότητα ισχύος μειώνεται γρήγορα με την απόσταση από μια πηγή χωρίς παραλληλισμένη δέσμη, επομένως μια λυχνία που μετακινείται από τα 2 cm στα 5 cm πάνω από την πλάκα μπορεί να μειώσει την πυκνότητα ισχύος κατά αρκετές φορές, ενώ η ενότητα των μεθόδων παραμένει ίδια. Χωρίς μετρημένη πυκνότητα ισχύος στην επιφάνεια του δείγματος, οι δημοσιευμένες ενεργειακές πυκνότητες που υπολογίζονται από τις ονομαστικές ισχείς του κατασκευαστή είναι εκτιμήσεις, όχι μετρήσεις.

Σχολιασμένος οδηγός παραμέτρων: τι κάνει μια έκθεση αναπαραγώγιμη

Το πρωτότυπο υλικό αυτής της σελίδας είναι μια λίστα ελέγχου. Κάθε έκθεση στο φως σε μια μελέτη που παραλείπει αυτά τα στοιχεία δεν μπορεί να συγκριθεί με κάποια άλλη, όσο παρόμοια κι αν φαίνεται η κύρια αναφερόμενη δόση.

1. Μήκος κύματος και εύρος ζώνης. Κορυφή και πλήρες εύρος, όχι ονομασία χρώματος. Τα ερυθρά LED καλύπτουν τα 630 έως 680 nm, όπου η απορρόφηση της χρωστικής διαφέρει πολύ.
2. Πυκνότητα ισχύος στην επιφάνεια του δείγματος, μετρημένη, σε mW ανά τετραγωνικό cm. Η ισχύς του κατασκευαστή σε watt δεν είναι πυκνότητα ισχύος.
3. Διάρκεια και παλμική λειτουργία. Συνεχής έναντι παλμικής εφαρμογής, συμπεριλαμβανομένων της συχνότητας παλμών και του κύκλου λειτουργίας, όπου ισχύει.
4. Ενεργειακή πυκνότητα υπολογισμένη από το παραπάνω ζεύγος μετρήσεων, σε J ανά τετραγωνικό cm.
5. Συγκέντρωση, σύνθεση και κατάσταση συσσωμάτωσης της χρωστικής. Το μονομερές κοντά στα 664 nm προκαλεί διαφορετική φωτοευαισθητοποίηση από τα συσσωματώματα κοντά στα 610 nm.
6. Διάστημα μεταξύ φαρμάκου και φωτός. Λεπτά έως ώρες μεταξύ χορήγησης της χρωστικής και ακτινοβόλησης, το οποίο καθορίζει πού βρίσκεται η χρωστική όταν φτάνει το φως.
7. Οξυγόνωση. Το αεριζόμενο διάλυμα σε σύγκριση με τον υποξικό ιστό αλλάζει άμεσα την ισορροπία μεταξύ Τύπου I και Τύπου II.
8. Γεωμετρία. Βάθος δείγματος, όγκος, τύπος δοχείου, απόσταση και γωνία πηγής και βάθος του ιστού-στόχου.

Μια χρήσιμη συνήθεια κατά την ανάγνωση δημοσιεύσεων: ελέγχετε πρώτα το διάστημα μεταξύ φαρμάκου και φωτός. Αποκαλύπτει την πρόθεση. Οι φωτοδυναμικοί σχεδιασμοί ακτινοβολούν σκόπιμα ιστό που περιέχει χρωστική. Οι συνδυαστικοί σχεδιασμοί μπορεί να διαχωρίζουν σκόπιμα τα δύο, όπως παρακάτω.

Η φωτοβιοτροποποίηση με εγγύς υπέρυθρο φως δεν είναι φωτοενεργοποίηση της χρωστικής

Η φωτοβιοτροποποίηση, που συνήθως συντομεύεται ως PBM, χρησιμοποιεί ερυθρό ή εγγύς υπέρυθρο φως για να τροποποιήσει την ενδογενή σηματοδότηση χωρίς προσθήκη φωτοευαισθητοποιητή. Η φωτοδυναμική θεραπεία, που συνήθως συντομεύεται ως PDT, χρησιμοποιεί τρία στοιχεία μαζί: φως που απορροφά ο φωτοευαισθητοποιητής, τον ίδιο τον φωτοευαισθητοποιητή και οξυγόνο, ώστε να δημιουργήσει μια απότομη παραγωγή δραστικών χημικών ειδών που βλάπτουν τον στόχο. Μια ανασκόπηση των μιτοχονδρίων ως στόχου νευροπροστασίας συνδυάζει το κυανό του μεθυλενίου με την PBM επειδή συγκλίνουν στην αναπνοή από διαφορετικές κατευθύνσεις: η χρωστική δρα ως καταλύτης επαναλαμβανόμενων κύκλων οξειδοαναγωγής, υποστηρίζοντας τη ροή ηλεκτρονίων, ενώ η PBM υποτίθεται ότι προάγει την αποδέσμευση του ανασταλτικού μονοξειδίου του αζώτου από την οξειδάση του κυτοχρώματος c στο Σύμπλοκο IV. Αυτός ο ενζυμικός μηχανισμός πρέπει να εξακολουθήσει να χαρακτηρίζεται ως υπόθεση.

Οι δύο συχνότερα αναφερόμενες συνδυαστικές μελέτες σε ποντίκια χρησιμοποιούν και οι δύο φως στα 810 nm, και ακριβώς γι’ αυτό δεν αποδεικνύουν φωτοενεργοποίηση της χρωστικής. Σε μια μελέτη προθεραπείας πριν από στέρηση ύπνου, τα ποντίκια λάμβαναν καθημερινά κυανό του μεθυλενίου σε 0.5 mg ανά kg, παλμικό λέιζερ στα 810 nm κάθε δεύτερη ημέρα ή και τα δύο πριν από τη στέρηση. Η συνδυασμένη προθεραπεία προστάτευσε τις συμπεριφορές που σχετίζονται με τη μνήμη και τις συναπτικές πρωτεΐνες του ιππόκαμπου, ενώ οι μεμονωμένες παρεμβάσεις απέτυχαν σε μεγάλο βαθμό. Σε μια μελέτη χρόνιου στρες με ταυτόχρονη θεραπεία, τα ποντίκια λάμβαναν PBM στα 810 nm με 8 J ανά τετραγωνικό cm μαζί με καθημερινή χρωστική σε 0.5 mg ανά kg, με το λέιζερ να εφαρμόζεται πρώτο και τη χρωστική να χορηγείται με ένεση δύο ώρες αργότερα, ειδικά για να αποφεύγεται η ακτινοβόληση ιστού που περιέχει χρωστική. Και οι τρεις ομάδες παρέμβασης ανέστρεψαν τα ελλείμματα μάθησης, με πρόσθετο όφελος κυρίως ως προς την κορτιζόλη ορού και τα δραστικά είδη οξυγόνου στον εγκέφαλο. Αυτά τα αποτελέσματα εξετάζουν δύο μιτοχονδριακές παρεμβάσεις που χρησιμοποιούνται μαζί, μια διάκριση που η συλλογή φωτοδυναμικών μελετών διατηρεί σαφή καταγράφοντας το μήκος κύματος ανά ένδειξη.

Τα δεδομένα για το δέρμα βρίσκονται στην άλλη πλευρά. Τα δεδομένα σε ανθρώπους για το κυανό του μεθυλενίου μαζί με φως στο δέρμα συγκεντρώνονται στα 630 έως 680 nm, με τοπική ή ενδοβλαβική χρωστική και στόχο την καταστροφή ή την αναδιαμόρφωση, κάτι που εξ ορισμού είναι PDT. Η επίκληση αυτής της εξάλειψης ως απόδειξης ότι η χρωστική ενισχύει την PBM, ή η επίκληση μιας αποκατάστασης σε ποντίκια στα 810 nm ως απόδειξης ότι ένα πάνελ στα 660 nm μαζί με χρωστική αποτελεί πρωτόκολλο για τη γνωστική λειτουργία, συγχέει τις δύο κατηγορίες εφαρμογής. Το υλικό αναφοράς για τη δοσολογία και τη φαρμακολογία και ο οδηγός ασφάλειας και αλληλεπιδράσεων αναπτύσσουν περαιτέρω τα ζητήματα της συγκέντρωσης και των αντενδείξεων.

Προσδιορίστε την έννοια πριν συγκρίνετε αριθμούς. Το μήκος κύματος καθορίζει αν η χρωστική απορροφά. Η πυκνότητα ισχύος και η διάρκεια καθορίζουν τι κάνει η χημεία με αυτή την απορρόφηση. Η γεωμετρία καθορίζει ποιο μέρος του δείγματος υφίσταται οποιαδήποτε από αυτές τις διεργασίες. Δύο εκθέσεις που ταυτίζονται σε μία παράμετρο και διαφέρουν στις υπόλοιπες είναι διαφορετικά πειράματα, και η αντιμετώπισή τους ως εναλλάξιμων είναι το σφάλμα που αυτός ο οδηγός επιδιώκει να αποτρέψει. Τίποτα από αυτά δεν συνεπάγεται πρωτόκολλο για οικιακή χρήση· το φως με συμβατό μήκος κύματος μαζί με συστηματικά χορηγούμενη χρωστική μετατρέπει μια κατά τα άλλα τροποποιητική έκθεση σε φωτοχημεία μέσω φωτοευαισθητοποιητή, η οποία ανήκει στα χέρια κλινικών επαγγελματιών.