Το κυανό του μεθυλενίου ως δείκτης αναεροβίωσης και οξυγόνου: τι αποδεικνύει η αλλαγή χρώματος

Μια τεχνικός σφραγίζει ένα αναερόβιο δοχείο, ελέγχει την ταινία δείκτη κυανού του μεθυλενίου μέσα από το καπάκι και βλέπει αυτό που θέλει να δει. Η ταινία έχει αλλάξει από μπλε σε λευκή. Καταγράφει τη διαδικασία ως αναερόβια και συνεχίζει. Δύο ημέρες αργότερα, σε ένα τρυβλίο δεν υπάρχει καμία ανάπτυξη, ενώ ένα σφραγισμένο σωληνάριο με ζωμό μέσα στο ίδιο δοχείο εμφανίζει ενδείξεις έκθεσης σε οξυγόνο. Η ταινία έλεγε την αλήθεια. Η τεχνικός της είχε θέσει τη λάθος ερώτηση.

Η σύγχυση αφορά τις ίδιες τις έννοιες. Ένας αναερόβιος δείκτης κυανού του μεθυλενίου αφορά την οξειδοαναγωγή, όχι τη στειρότητα ούτε την επικύρωση ολόκληρου του συστήματος. Μόλις γίνει σαφής αυτή η διάκριση, η ταινία γίνεται ένα ακριβές και αξιόπιστο όργανο με περιορισμένο ρόλο.

Η βασική έννοια: ένα αναστρέψιμο οξειδοαναγωγικό ζεύγος

Το διαλυμένο κυανό του μεθυλενίου υπάρχει σε δύο καταστάσεις. Η οξειδωμένη μορφή είναι το γνωστό μπλε κατιόν. Η ανηγμένη μορφή, που ονομάζεται λευκοκυανό του μεθυλενίου, είναι άχρωμη. Κοντά στο ουδέτερο pH, η απλουστευμένη ημιαντίδραση είναι ένα μπλε κατιόν συν ένα πρωτόνιο συν δύο ηλεκτρόνια, που δίνουν ένα άχρωμο μόριο λευκομορφής. Το τυπικό δυναμικό είναι κοντά στα συν 11 millivolts ως προς το πρότυπο ηλεκτρόδιο υδρογόνου σε pH 7, γεγονός που το τοποθετεί σε ένα εύρος το οποίο μπορούν να επιτύχουν πολλά αναγωγικά συστήματα και στο οποίο το οξυγόνο μπορεί να αντιστρέψει την αναγωγή.

Η αναγωγή απαιτεί χαμηλό τοπικό οξειδοαναγωγικό δυναμικό. Η απομάκρυνση του οξυγόνου από μόνη της δεν αρκεί πάντα. Πρώιμες εργασίες για την αναεροβίωση διαπίστωσαν ότι το κυανό του μεθυλενίου σε απλό νερό χωρίς οξυγόνο διατηρούσε το χρώμα του, εκτός αν υπήρχε κάποια αναγωγική ουσία, και ότι μείγματα ζωμού δεξτρόζης με περίπου 0.01 τοις εκατό χρωστική αποχρωματίζονταν εύκολα στους 37 C, ενώ το ίδιο μείγμα στους 4 C παρέμενε μπλε για μία ημέρα, όπως αναφέρεται σε πειράματα με νωπό ιστό και συνθήκες αναερόβιας καλλιέργειας. Η θερμοκρασία, το pH, η γλυκόζη, το ασκορβικό, το θειογλυκολικό και η μικροβιακή αναγωγική δραστηριότητα καθορίζουν αν υπάρχουν διαθέσιμα ηλεκτρόνια.

Η επανοξείδωση χρειάζεται μόνο οξυγόνο. Όταν ο αέρας φτάνει στη λευκομορφή, αυτή μετατρέπεται ξανά στη μπλε μορφή. Οι σύγχρονοι σχεδιασμένοι δείκτες αξιοποιούν ακριβώς αυτόν τον κύκλο: χρωστική συν αναγωγικό μέσο συν σταθεροποιητική μήτρα, άχρωμη σε χαμηλό οξυγόνο και ξανά μπλε με την έκθεση στον αέρα, όπως αποδείχθηκε σε έναν υβριδικό δείκτη οξυγόνου με κυανό του μεθυλενίου, βασισμένο σε χρωστική, αναγωγικό μέσο, επιφανειοδραστικό και άργιλο. Εκείνο το πρωτότυπο χρησιμοποιούσε 0.01 millimolar χρωστικής με 2.0 millimolar ασκορβικού ή γλυκόζης σε pH 11, γινόταν άχρωμο κοντά στο 0.5 τοις εκατό οξυγόνου κατ’ όγκο και διέκρινε συγκεντρώσεις κάτω από 0.1 τοις εκατό από συγκεντρώσεις πάνω από 0.5 τοις εκατό οξυγόνου στον θάλαμο δοκιμής του.

Η αρχή λειτουργίας είναι λοιπόν απλή. Το μπλε σημαίνει ότι η ζώνη του δείκτη είναι οξειδωμένη. Το άχρωμο σημαίνει ότι η ζώνη του δείκτη έχει φτάσει σε αναγωγικές συνθήκες με χαμηλό οξυγόνο. Η αλλαγή είναι αναστρέψιμη, τοπική και χημική. Από μόνη της δεν λέει τίποτα για τα μικρόβια.

Πώς λειτουργεί μια ταινία δείκτη κυανού του μεθυλενίου σε αναερόβιο δοχείο

Μια ταινία δείκτη κυανού του μεθυλενίου για αναερόβιο δοχείο είναι μια μικρή ζώνη αντίδρασης, τοποθετημένη στην ατμόσφαιρα του δοχείου έτσι ώστε να είναι ορατή χωρίς να ανοίξει το δοχείο. Οι εμπορικές μορφές διαφέρουν: χάρτινες ταινίες, δισκία που διαλύονται ή διαβρέχονται κατά την προετοιμασία και νεότερα υβριδικά χαρτιά. Ορισμένες χρειάζονται μία σταγόνα απεσταγμένου νερού για να ενεργοποιηθεί η ζώνη αντίδρασης. Άλλες είναι διατάξεις ξηρής μορφής που πρέπει να παραμένουν στεγνές. Ισχύουν οι οδηγίες του συγκεκριμένου προϊόντος, επειδή η ενυδάτωση, η τοποθέτηση και ο χρόνος ανάγνωσης αποτελούν μέρος της χημείας.

Στην πράξη, η προβλεπόμενη ανάγνωση είναι δυαδική. Το μπλε σημαίνει ότι στην ταινία εξακολουθεί να υπάρχει οξυγόνο ή ότι οι συνθήκες δεν είναι επαρκώς αναγωγικές. Το λευκό ή άχρωμο σημαίνει ότι έχουν εγκατασταθεί αναερόβιες οξειδοαναγωγικές συνθήκες στην ταινία. Ορισμένα εμπορικά χαρτιά περιέχουν μια κόκκινη χρωστική υποβάθρου, οπότε το τελικό χρώμα της ανηγμένης μορφής τους είναι ροζ αντί για λευκό. Πριν αξιολογήσετε το προϊόν σας, πρέπει να γνωρίζετε ποιο τελικό χρώμα προβλέπει.

Ο χρόνος διαφέρει ανάλογα με το σύστημα. Σε μία διάταξη τύπου GasPak, η εξασθένηση του χρώματος άρχισε μέσα σε περίπου μία ώρα και ολοκληρώθηκε μέσα σε λίγες ώρες, ενώ σε μια ελεγχόμενη σύγκριση σε θερμοκρασία δωματίου το κυανό του μεθυλενίου χρειάστηκε περισσότερες από έξι ώρες. Σε εκείνη την εργασία, το οξειδοαναγωγικό δυναμικό των θρεπτικών υλικών έφτασε περίπου στα μείον 100 millivolts μέσα σε 60 έως 100 λεπτά, πολύ πριν ολοκληρωθεί η αλλαγή της χρωστικής, και βρισκόταν αρκετά κάτω από τα μείον 200 millivolts όταν η ταινία έγινε εντελώς άχρωμη. Ο δείκτης αποκρίνεται με καθυστέρηση σε σχέση με την ατμόσφαιρα. Μια μπλε ταινία στην πρώτη ώρα δεν αποδεικνύει αποτυχία, και μια λευκή ταινία στην έκτη ώρα περιγράφει την κατάσταση της ταινίας στην έκτη ώρα.

Για τον ίδιο λόγο έχει σημασία η τοποθέτηση. Διατηρείτε την ταινία στον αέριο χώρο του δοχείου, ορατή μέσα από το καπάκι, μακριά από επιφάνειες άγαρ και θρεπτικά υλικά καλλιέργειας. Αναφέρει την κατάσταση του άμεσου περιβάλλοντός της. Αν την τοποθετήσετε επίπεδη πάνω σε ένα ψυχρό τοίχωμα, τη θάψετε κάτω από τρυβλία ή αφήσετε το συμπύκνωμα να τη μουσκέψει, αναφέρει την κατάσταση αυτού του μικροπεριβάλλοντος αντί για την κατάσταση του δοχείου.

Τι αποκαλύπτει η ταινία και τι όχι

Σκεφτείτε τον δείκτη κυανού του μεθυλενίου του αναερόβιου δοχείου ως έναν αισθητήρα σε μία θέση. Τεκμηριώνει τις τοπικές συνθήκες οξειδοαναγωγής και οξυγόνου στη δική του ζώνη αντίδρασης, οι οποίες είναι γενικά αντιπροσωπευτικές του αέριου χώρου αν η ανάμειξη και η εξισορρόπηση είναι επαρκείς. Οτιδήποτε πέρα από αυτό αποτελεί συμπέρασμα, και κάθε συμπέρασμα χρειάζεται ξεχωριστή τεκμηρίωση.

Μια άχρωμη ταινία δεν τεκμηριώνει τη στειρότητα. Στειρότητα είναι η απουσία βιώσιμων οργανισμών, η οποία αποδεικνύεται με επικυρωμένη αποστείρωση και ελέγχους επικύρωσης της καλλιέργειας. Ένα δοχείο μπορεί να είναι πλήρως αναερόβιο και παρ’ όλα αυτά επιμολυσμένο, ή πλήρως στείρο και παρ’ όλα αυτά αερόβιο.

Δεν επικυρώνει κάθε μέρος του συστήματος καλλιέργειας. Το διαλυμένο οξυγόνο μέσα σε ένα σφραγισμένο σωληνάριο, το οξυγόνο που είναι παγιδευμένο σε βαθύ άγαρ, οι βαθμίδες συγκέντρωσης σε ένα γεμάτο δοχείο και μια διαρροή που εμφανίζεται μετά την ανάγνωση δεν καλύπτονται από μία ταινία. Πειράματα χωρικής κατανομής έδειξαν γειτονικές μπλε και άχρωμες ζώνες στο ίδιο δοχείο, όπου η διείσδυση του οξυγόνου και η αναγωγική δραστηριότητα εξισορροπούνταν διαφορετικά. Ένα σημείο δεν μπορεί να πιστοποιήσει έναν όγκο.

Δεν αποδεικνύει αδιάλειπτη αναεροβίωση. Μια ταινία που διαβάζεται μία φορά κατά την προετοιμασία δεν λέει τίποτα για την εικοστή ώρα. Πρόσφατες εργασίες για την ποιότητα των αναερόβιων συνθηκών προειδοποιούν ότι οι χημικοί δείκτες περιγράφουν την ατμόσφαιρα τη στιγμή που διαβάζονται και μπορεί να φαίνονται ικανοποιητικοί παρά την παρουσία χαμηλού υπολειμματικού οξυγόνου. Η συνεχής τεκμηρίωση ή η τεκμηρίωση σε σημεία ελέγχου, και όχι μια μοναδική ματιά στο τελικό χρώμα, είναι αυτό που συνδέει την ταινία με την επώαση.

Για τη σχετική χημεία πίσω από την αλλαγή χρώματος, δείτε πώς το κυανό του μεθυλενίου εναλλάσσεται μεταξύ οξειδωμένης και ανηγμένης κατάστασης. Για το πώς το οξυγόνο επηρεάζει γενικότερα τον χειρισμό των δειγμάτων, δείτε τον έλεγχο του οξυγόνου στη μικροσκοπία και στις εργασίες καλλιέργειας.

Ένα διάγραμμα για να έχετε δίπλα στο δοχείο

Η παρακάτω εικόνα συνοψίζει το άρθρο σε ένα βοήθημα αναφοράς για τον εργαστηριακό πάγκο. Τρεις καταστάσεις της ίδιας ταινίας, οι δύο κατευθύνσεις της αντίδρασης και το όριο μεταξύ της ένδειξης που παρέχει ο δείκτης και της επικύρωσης του συστήματος.

Αστοχίες που κρατούν την ταινία μπλε ή δημιουργούν ψευδή ασφάλεια

Οι περισσότερες αστοχίες ανήκουν σε πέντε ομάδες. Καθεμία έχει χαρακτηριστικές ενδείξεις.

Ένα δοχείο ή ένας σάκος με διαρροή συνεχίζει να τροφοδοτεί τη ζώνη αντίδρασης με οξυγόνο. Η ταινία παραμένει μπλε ή ξαναγίνεται μπλε αφού εξασθενήσει το χρώμα της. Ελέγξτε το καπάκι, το παρέμβυσμα, τους σφιγκτήρες και τις επιφάνειες στεγανοποίησης πριν αποδώσετε το πρόβλημα στη χημεία.

Μια εξαντλημένη ή λανθασμένα ενεργοποιημένη γεννήτρια αερίου δεν απομακρύνει ποτέ το οξυγόνο. Στα παλαιότερα συστήματα που ενεργοποιούνταν με νερό, η απουσία συμπύκνωσης γύρω στα 10 έως 15 λεπτά και η απουσία θέρμανσης του καπακιού γύρω στα 20 έως 40 λεπτά αποτελούσαν πρώιμες προειδοποιήσεις για το συγκεκριμένο σύστημα. Ένας φακελίσκος ανεπαρκούς δυναμικότητας σε υπερφορτωμένο δοχείο αποτυγχάνει με τον ίδιο τρόπο.

Η δηλητηρίαση του καταλύτη αφορά μόνο παλαιότερα συστήματα υδρογόνου και παλλαδίου, όπου το παλλάδιο συνδυάζει το υδρογόνο και το οξυγόνο σε νερό. Η υγρασία και το υδρόθειο υποβαθμίζουν τη λειτουργία του. Πολλοί σημερινοί φακελίσκοι δεν χρησιμοποιούν καθόλου παλλάδιο, επομένως μην εφαρμόζετε αυτή τη διορθωτική ενέργεια όπου δεν αρμόζει.

Μια αλλοιωμένη ταινία ή μια ταινία που έχει υποστεί λανθασμένο χειρισμό αστοχεί χωρίς εμφανή προειδοποίηση. Η χρωστική και το αναγωγικό μέσο χάνουν την αναστρεψιμότητά τους κατά την αποθήκευση, γεγονός που αποτελεί έναν από τους λόγους για τους οποίους αναπτύχθηκαν υβριδικές συνθέσεις ανθεκτικές στον φωτοαποχρωματισμό και στην απώλεια λειτουργικότητας κατά την αποθήκευση. Απορρίπτετε ληγμένα αποθέματα, αποθέματα με μη φυσιολογικό αρχικό χρώμα και ταινίες που διαβράχηκαν ενώ έπρεπε να παραμείνουν στεγνές ή έμειναν στεγνές ενώ απαιτούσαν διαβροχή.

Μια βαθμίδα συγκέντρωσης ή μια καθυστέρηση παραπλανά τον αναγνώστη και όχι τη χημεία. Ο ανεπαρκώς αναμεμειγμένος αέριος χώρος, τα σφραγισμένα σωληνάρια με διαλυμένο οξυγόνο και τα ημιστερεά θρεπτικά υλικά διατηρούν το καθένα τις δικές του συνθήκες για περισσότερο χρόνο από όσο υποδηλώνει η ταινία. Οι ταινίες ρεσαζουρίνης περνούν από το ροζ στο άχρωμο και συχνά προωθούνται ως ταχύτερες, αλλά τα κατώφλιά τους αφορούν τη δική τους σύνθεση και δεν ισχύουν για το κυανό του μεθυλενίου.

Έλεγχοι και ένα πρωτόκολλο ανάγνωσης που αξίζει να υιοθετήσετε

Δύο οικονομικοί έλεγχοι εντοπίζουν τις περισσότερες λανθασμένες αναγνώσεις. Διατηρείτε μια φρέσκια ταινία ελέγχου έκθεσης στον αέρα, στον αέρα του δωματίου, παράλληλα με τη διαδικασία. Μια λειτουργική ταινία κυανού του μεθυλενίου παραμένει εκεί μπλε. Ορισμένοι συσκευασμένοι δείκτες αρχικά είναι ωχροί και γίνονται μπλε με το άνοιγμα, κάτι που αποτελεί από μόνο του έλεγχο λειτουργίας. Επίσης, τοποθετείτε περιοδικά μια φρέσκια ταινία σε μια προηγουμένως επικυρωμένη αναερόβια διάταξη. Θα πρέπει να φτάνει στο επικυρωμένο τελικό χρώμα της ανηγμένης μορφής μέσα στον χρόνο που ορίζει το προϊόν. Αν οποιοσδήποτε από τους δύο ελέγχους παρουσιάσει μη αναμενόμενη συμπεριφορά, αντικαταστήστε την παρτίδα πριν εμπιστευτείτε τις ενδείξεις του δοχείου.

Το πρωτόκολλο ανάγνωσης προκύπτει από τον μηχανισμό. Τοποθετήστε την ταινία στον αέριο χώρο, σε σημείο ορατό χωρίς να ανοίξετε το δοχείο, ακολουθώντας τις οδηγίες του προϊόντος για την επαφή με το τοίχωμα και τη διαβροχή. Καταγράψτε το αρχικό χρώμα, την ώρα που σφραγίστηκε το δοχείο και το χρώμα στο σημείο ελέγχου που ορίζει το προϊόν. Όπου το δοχείο το επιτρέπει, καταγράψτε ότι ο δείκτης παρέμεινε στην ανηγμένη κατάσταση σε καθορισμένα σημεία ελέγχου κατά την επώαση. Καταγράψτε το τελικό χρώμα αμέσως πριν από το άνοιγμα. Αυτό το χρώμα πριν από το άνοιγμα είναι το τελικό αποτέλεσμα για τη συγκεκριμένη διαδικασία. Μετά το άνοιγμα, αναμένετε επαναφορά στο μπλε και μην την αφήνετε να αλλάξει αναδρομικά την καταγραφή.

Αν η ταινία παραμένει μπλε μετά τον καθορισμένο χρόνο της, θεωρήστε την αναεροβίωση μη επιβεβαιωμένη. Ελέγξτε διαδοχικά την αλυσίδα: στεγανότητα, φακελίσκος, καταλύτης αν υπάρχει, ενυδάτωση και λήξη του δείκτη και, στη συνέχεια, λειτουργία του δείκτη σε σύγκριση με τον έλεγχο έκθεσης στον αέρα. Μόνο όταν επιβεβαιωθεί η ατμόσφαιρα πρέπει να ερμηνεύεται η ανάπτυξη ή η απουσία ανάπτυξης, με διάταξη αναερόβιας καλλιέργειας και ελέγχους οργανισμών κατάλληλους για την εφαρμογή.

Η ταινία δικαιούται τον τελευταίο λόγο στο δικό της πεδίο. Μπλε ή άχρωμη, απαντά σε μία ερώτηση για ένα σημείο σε μία χρονική στιγμή. Θέστε της αυτή την ερώτηση στον προβλεπόμενο χρόνο, με ελέγχους δίπλα της, και απαντά αξιόπιστα. Ρωτήστε τη για τη στειρότητα, για κάθε σωληνάριο ή για ολόκληρη την επώαση με μία μόνο ματιά, και καμία χημεία δείκτη δεν μπορεί να σώσει την ερμηνεία.