Γιατί το κυανό του μεθυλενίου χρησιμοποιείται ως αντιχρώση στην οξεάντοχη χρώση

Ένας τεχνολόγος εξετάζει ένα επίχρισμα πτυέλων μετά την ολοκλήρωση όλων των σταδίων χρώσης. Κόκκινα ραβδία ξεχωρίζουν σε μπλε πεδίο και η έκθεση αναφέρει ότι παρατηρήθηκαν οξεάντοχοι βάκιλλοι. Την επόμενη ημέρα, μια διαφορετική αντικειμενοφόρος πλάκα παρουσιάζει ομοιόμορφο μπλε πεδίο χωρίς κόκκινα ραβδία και αναφέρεται ως αρνητική για φυματίωση. Μία από αυτές τις εκθέσεις διατυπώνει συμπέρασμα που δεν τεκμηριώνεται από την πλάκα, και δεν είναι η πρώτη.

Η σύγχυση είναι εννοιολογική. Ο τεχνολόγος αντιμετώπισε την μπλε χρωστική ως μέρος της χημείας της ανίχνευσης, σαν το κυανό του μεθυλενίου να βοηθούσε στον εντοπισμό των μυκοβακτηριδίων. Δεν το έκανε. Όταν το κυανό του μεθυλενίου έρχεται σε επαφή με την πλάκα, η δοκιμασία έχει ήδη ολοκληρωθεί. Η χρωστική απλώς χρωματίζει το υπόβαθρο, ώστε το αποτέλεσμα να είναι ευανάγνωστο. Το άρθρο αυτό εξηγεί τον σκοπό του κυανού του μεθυλενίου στην οξεάντοχη χρώση, γιατί χρησιμοποιείται το μπλε και όχι κάποιο άλλο χρώμα και ποια συμπεράσματα επιτρέπει η εικόνα του κόκκινου σε μπλε υπόβαθρο.

Η σύντομη απάντηση

Η οξεάντοχη χρώση είναι μια διαφορική δοκιμασία που βασίζεται σε τρεις αρχές. Η καρβολική φουξίνη, η κύρια χρωστική, εισάγεται εξαναγκασμένα σε κάθε κύτταρο, συμπεριλαμβανομένων των μυκοβακτηριδίων με το κηρώδες περίβλημα. Η όξινη αλκοόλη, ο αποχρωματιστικός παράγοντας, αφαιρεί την κόκκινη χρωστική από τα συνήθη κύτταρα, αλλά δεν καταφέρνει να την εκχυλίσει από τα οξεάντοχα. Το κυανό του μεθυλενίου, η αντιχρωστική, χρωματίζει στη συνέχεια οτιδήποτε αποχρωματίστηκε, ώστε τα μη οξεάντοχα κύτταρα, τα κύτταρα του ξενιστή και τα υπολείμματα να εμφανίζονται μπλε, ενώ οι οξεάντοχοι βάκιλλοι παραμένουν κόκκινοι. Η αντιχρώση προσφέρει αντίθεση. Δεν συμμετέχει στη χημεία που καθιστά ένα κύτταρο οξεάντοχο.

Τι κάνει κάθε στάδιο

Το παρακάτω διάγραμμα δείχνει τον καταμερισμό των ρόλων. Διαβάστε το από αριστερά προς τα δεξιά ως διαδικασία και την κάτω λωρίδα ως υπενθύμιση ότι κάθε οικογένεια χρώσεων απαντά σε διαφορετικό ερώτημα.

Πρώτα έρχεται η διείσδυση. Τα μυκοβακτηρίδια αντιστέκονται στις συνήθεις υδατικές χρωστικές επειδή το περίβλημά τους είναι ασυνήθιστα υδρόφοβο, οπότε το πρωτόκολλο εξαναγκάζει την είσοδο. Στη μέθοδο Ziehl-Neelsen, η θέρμανση μέχρι την παραγωγή ατμών προωθεί την καρβολική φουξίνη που περιέχει φαινόλη μέσα από το κηρώδες τοίχωμα. Στην ψυχρή μέθοδο Kinyoun, η θερμότητα αντικαθίσταται από μια πολύ ισχυρότερη σύνθεση της κύριας χρωστικής, ενώ ορισμένες τροποποιημένες εκδοχές χωρίς θέρμανση προσθέτουν επιφανειοδραστικές ουσίες. Τα πρωτόκολλα οξεάντοχης χρώσης της Αμερικανικής Εταιρείας Μικροβιολογίας παρουσιάζουν τις δύο συνθέσεις δίπλα δίπλα, και η διαφορά συγκέντρωσης είναι εντυπωσιακή: περίπου 0.3 g βασικής φουξίνης ανά 100 mL για τη μέθοδο με θέρμανση έναντι περίπου 4 g για την ψυχρή μέθοδο.

Δεύτερη έρχεται η διαφοροποίηση. Η όξινη αλκοόλη, συνήθως 3 mL πυκνού υδροχλωρικού οξέος σε 97 mL αιθανόλης 95 τοις εκατό, απομακρύνει την κόκκινη χρωστική από κάθε κύτταρο του οποίου το τοίχωμα δεν προσφέρει ιδιαίτερη αντίσταση. Τα κύτταρα με άθικτο μυκοβακτηριδιακό λιπιδικό περίβλημα διατηρούν τη χρωστική. Αυτό είναι το στάδιο στο οποίο βασίζεται ολόκληρη η μέθοδος και εκείνο που επηρεάζεται περισσότερο από την τεχνική, όπως συζητείται παρακάτω.

Τελευταία έρχεται η αντίθεση. Η πλάκα περιέχει πλέον κόκκινα οξεάντοχα κύτταρα σε σχεδόν άχρωμο υπόβαθρο αποχρωματισμένων κυττάρων. Το κυανό του μεθυλενίου σε συγκέντρωση 0.3 τοις εκατό w/v επαναφέρει την ορατότητα αυτού του υποβάθρου με ένα χρώμα που απέχει όσο το δυνατόν περισσότερο από το κόκκινο. Η αντιχρώση είναι σύντομη, συνήθως 20 έως 30 δευτερόλεπτα στη μέθοδο με θέρμανση και έως λίγα λεπτά σε ορισμένες παραλλαγές της ψυχρής μεθόδου. Η διάρκειά της εξαρτάται από το πρωτόκολλο και δεν αποτελεί ιδιότητα της ίδιας της χρωστικής.

Γιατί αυτή η χρωστική και γιατί μπλε

Το κυανό του μεθυλενίου είναι κατιονική βασική χρωστική, που σημαίνει ότι το έγχρωμο ιόν του φέρει θετικό φορτίο και συνδέεται με τις αρνητικά φορτισμένες επιφάνειες αποχρωματισμένων βακτηρίων, κυττάρων του ξενιστή και υπολειμμάτων. Το εγχειρίδιο Μικροβιολογίας του OpenStax περιγράφει αυτή τη λογική των φορτίων ως τη γενική αρχή πίσω από τις βασικές χρωστικές. Ωστόσο, το κυανό του μεθυλενίου δεν είναι χημικά μοναδικό ως προς αυτό. Το κρυσταλλικό ιώδες και η σαφρανίνη είναι επίσης βασικές χρωστικές. Η επιλογή είναι οπτική, όχι χημική.

Τα κόκκινα ραβδία χρειάζονται υπόβαθρο με αντίθετη απόχρωση και το μπλε αντιπαρατίθεται στο κόκκινο με τον πιο χρήσιμο τρόπο για τη μικροσκοπία φωτεινού πεδίου. Η σαφρανίνη θα ήταν ακατάλληλη αντιχρωστική επειδή το τελικό ροζ-κόκκινο χρώμα της είναι πολύ κοντά στην καρβολική φουξίνη που έχει συγκρατηθεί, εξαλείφοντας ακριβώς τη διάκριση που δημιούργησε η διαδικασία. Το κρυσταλλικό ιώδες θα έδινε σκούρο ιώδες υπόβαθρο που θα ανταγωνιζόταν τους λεπτούς κόκκινους βακίλλους για την προσοχή του παρατηρητή. Η ισχυρότερη ένδειξη ότι ο ρόλος αφορά την αντίθεση και όχι τη χημεία είναι η δυνατότητα αντικατάστασης: πράσινες αντιχρωστικές, όπως το πράσινο του μαλαχίτη και το λαμπρό πράσινο, χρησιμοποιούνται σε ορισμένα κτηνιατρικά και τροποποιημένα πρωτόκολλα, και η δοκιμασία εξακολουθεί να λειτουργεί, επειδή οποιαδήποτε σαφώς διαφορετική απόχρωση επιτελεί τον ίδιο ρόλο.

Προκύπτουν δύο πρακτικές συνέπειες. Πρώτον, η τυπική σύνθεση δεν προβλέπει ρύθμιση του pH· μην συγχέετε αυτό το απλό υδατικό διάλυμα 0.3 τοις εκατό με αλκαλικές συνθέσεις όπως το κυανό του μεθυλενίου κατά Loeffler, οι οποίες ανήκουν σε διαφορετική λογική χρώσης. Δεύτερον, η υπερβολή βλάπτει. Η ιστολογική βιβλιογραφία προειδοποιεί ειδικά ότι ένα υπερβολικά έντονο μπλε υπόβαθρο μπορεί να αποκρύψει ολιγάριθμους βακίλλους. Επομένως, η παρατεταμένη κάλυψη της πλάκας με χρωστική πέρα από τον χρόνο που επιτρέπει το πρωτόκολλο μειώνει την ευκρίνεια χωρίς κανένα όφελος.

Η χημεία του τοιχώματος που καθιστά δυνατή τη δοκιμασία

Ο λόγος για τον οποίο η όξινη αλκοόλη επιτυγχάνει τη διάκριση βρίσκεται στο μυκοβακτηριδιακό περίβλημα. Ο δομικός του πυρήνας είναι το σύμπλοκο μυκολυλίου-αραβινογαλακτάνης-πεπτιδογλυκάνης: πεπτιδογλυκάνη συνδεδεμένη με αραβινογαλακτάνη, της οποίας τα εξωτερικά άκρα φέρουν μυκολικά οξέα πολύ μακράς αλυσίδας, σχηματίζοντας μια εξωτερική μυκομεμβράνη πλούσια σε λιπίδια και ασυνήθιστα χαμηλής διαπερατότητας. Η ανασκόπηση της εξωτερικής μεμβράνης των μυκοβακτηριδίων περιγράφει λεπτομερώς αυτή την αρχιτεκτονική. Ο φραγμός λειτουργεί και προς τις δύο κατευθύνσεις. Αντιστέκεται στην είσοδο της χρωστικής, γι’ αυτό η διείσδυση απαιτεί θερμότητα ή ενισχυμένη κύρια χρωστική, και αντιστέκεται στην εκχύλισή της, γι’ αυτό η όξινη αλκοόλη δεν καταφέρνει να απομακρύνει την καρβολική φουξίνη αφού εισέλθει. Τα συνήθη βακτήρια δεν διαθέτουν αυτό το περίβλημα και χάνουν τη χρωστική. Επομένως, η οξεαντοχή γίνεται καλύτερα κατανοητή ως φαινόμενο λιπιδικού φραγμού και όχι ως χημική σύνδεση της φουξίνης με το μυκολικό οξύ.

Αυτή η χημεία εξηγεί επίσης ένα συνηθισμένο αίνιγμα: τα μυκοβακτηρίδια χρωματίζονται ανεπαρκώς και απρόβλεπτα με τη μέθοδο Gram, εμφανιζόμενα μερικές φορές ως αμυδρές κομβολογιοειδείς μορφές ή άχρωμα περιγράμματα. Το υδρόφοβο τοίχωμά τους περιορίζει τη διείσδυση του κρυσταλλικού ιώδους. Η οξεάντοχη χρώση δεν είναι τροποποιημένη χρώση Gram. Είναι μια διαφορετική διαφορική αρχή που βασίζεται σε διαφορετική ιδιότητα του τοιχώματος, όπως δείχνει για τις άλλες δύο μεθόδους η σύγκριση της απλής χρώσης με τη χρώση Gram.

Τρεις μέθοδοι, τρία ερωτήματα

Για την ευρύτερη οικογένεια βακτηριακών μεθόδων με μία χρωστική, δείτε τον άτλαντα χρώσεων μικροσκοπίας.

Τι δεν μπορεί να αποδείξει το κόκκινο σε μπλε υπόβαθρο

Τα κόκκινα ραβδία σημαίνουν ότι οι οργανισμοί συγκράτησαν την καρβολική φουξίνη παρά την εφαρμογή όξινης αλκοόλης. Το εύρημα αυτό είναι συμβατό με το Mycobacterium tuberculosis, αλλά οι διαγνωστικές οδηγίες του CDC για τη φυματίωση επισημαίνουν ρητά ότι και άλλα μυκοβακτηρίδια είναι οξεάντοχα. Επομένως, η ταυτοποίηση του είδους απαιτεί καλλιέργεια και εξετάσεις νουκλεϊκών οξέων, όχι χρώμα.

Τα τεχνικά σφάλματα συγκεντρώνονται γύρω από τις δύο εκπλύσεις. Ο ανεπαρκής αποχρωματισμός αφήνει το υλικό του υποβάθρου κόκκινο και ευνοεί ψευδώς θετικές αναγνώσεις. Ο υπερβολικός αποχρωματισμός αφαιρεί την κύρια χρωστική που έχει συγκρατηθεί ασθενώς και συμβάλλει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Η υπερβολικά έντονη αντιχρώση κρύβει ολιγάριθμους βακίλλους μέσα στο μπλε. Τα παχιά επιχρίσματα, τα αντιδραστήρια με ιζήματα και το μολυσμένο νερό έκπλυσης προσθέτουν τα δικά τους τεχνουργήματα.

Η ευαισθησία περιορίζεται από το μικροβιακό φορτίο, όσο σωστή και αν είναι η τεχνική. Η συμβατική μικροσκοπία επιχρίσματος απαιτεί περίπου 5,000 έως 10,000 βακίλλους ανά χιλιοστόλιτρο πτυέλων, ενώ παλαιότερες ανασκοπήσεις τεκμηρίων του CDC τοποθετούσαν την ευαισθησία του επιχρίσματος περίπου στο 45 έως 80 τοις εκατό μεταξύ πνευμονικών περιστατικών επιβεβαιωμένων με καλλιέργεια. Συνεπώς, ένα αρνητικό επίχρισμα δεν αποκλείει ποτέ τη φυματίωση. Οι τρέχουσες οδηγίες του CDC διατηρούν την καλλιέργεια παράλληλα με κάθε επίχρισμα και συνιστούν εξέταση ενίσχυσης νουκλεϊκών οξέων σε τουλάχιστον ένα αναπνευστικό δείγμα όταν εξετάζεται το ενδεχόμενο πνευμονικής φυματίωσης και το αποτέλεσμα θα άλλαζε τη διαχείριση.

Η πρακτική εφαρμογή διέπεται από εγκεκριμένα πρωτόκολλα

Οι εκπαιδευτικές περιγραφές, συμπεριλαμβανομένου αυτού του άρθρου, δεν παρέχουν εξουσιοδότηση για κλινική εργασία. Για την εργαστηριακή πρακτική, ακολουθήστε την επικυρωμένη τυποποιημένη διαδικασία λειτουργίας του εργαστηρίου, ευθυγραμμισμένη με τα ισχύοντα έγγραφα του CDC, της APHL ή του CLSI· το έγγραφο αναφοράς του CDC για την οξεάντοχη χρώση που φυλάσσεται στο αρχείο Stacks δείχνει πώς τέτοιες διαδικασίες προσδιορίζουν τα αντιδραστήρια και τα κριτήρια ανάγνωσης. Η εργασία με δείγματα φυματίωσης απαιτεί μέτρα περιορισμού: τα επιχρίσματα παρασκευάζονται σε θάλαμο βιολογικής ασφάλειας, επειδή η παρασκευή παράγει αερολύματα και πιτσιλίσματα. Οι οδηγίες εργαστηριακής ασφάλειας του CDC αναφέρουν ότι ακόμη και τα θερμικά μονιμοποιημένα επιχρίσματα μπορεί να περιέχουν βιώσιμους βακίλλους της φυματίωσης και πρέπει να εξακολουθούν να αντιμετωπίζονται ως μολυσμένα. Η καταχώριση στη Βιβλιοθήκη Εικόνων Δημόσιας Υγείας του CDC για επίχρισμα με καρβολική φουξίνη και κυανό του μεθυλενίου που εξετάστηκε για M. leprae αποτελεί χρήσιμη υπενθύμιση του εύρους της μεθόδου πέρα από τη φυματίωση: η ίδια αντίθεση κόκκινου σε μπλε υπόβαθρο χρησιμοποιείται όπου αναζητούνται οξεάντοχοι οργανισμοί, και μια προσεκτική αρνητική ανάγνωση αποτελεί από μόνη της αποτέλεσμα που αξίζει να καταγραφεί.

Ανάγνωση της ολοκληρωμένης πλάκας

Η αντιχρώση αποδεικνύει την αξία της κατά τη σάρωση. Ο μικροσκοπιστής που εξετάζει αρχικά με χαμηλή μεγέθυνση χρησιμοποιεί το μπλε υπόβαθρο για να κρίνει την ποιότητα του επιχρίσματος: ομοιόμορφη κατανομή κυττάρων, άθικτα κύτταρα του ξενιστή για εστίαση, απουσία έντονου ιζήματος. Οι πιθανές κόκκινες μορφές τραβούν στη συνέχεια το βλέμμα ακριβώς επειδή τίποτε άλλο στην πλάκα δεν είναι κόκκινο. Η επιβεβαίωση γίνεται με ελαιοκατάδυση, όπου οι πραγματικοί βάκιλλοι εμφανίζονται ως τα αναμενόμενα λεπτά, μερικές φορές ελαφρώς καμπύλα ή κομβολογιοειδή ραβδία, αντί για ομοιόμορφα υπολείμματα χρωστικής.

Η χρώση του υποβάθρου καθορίζει επίσης τη διατύπωση της έκθεσης. Μια πλάκα με κόκκινους βακίλλους αναφέρεται ως παρουσία οξεάντοχων βακίλλων, συχνά με ημιποσοτική διαβάθμιση σύμφωνα με την κλίμακα του εργαστηρίου. Μια πλάκα χωρίς κόκκινους οργανισμούς αναφέρεται ως μη παρατήρηση οξεάντοχων βακίλλων, ποτέ ως αρνητική για φυματίωση. Η διάκριση έχει σημασία επειδή το μπλε πεδίο αποδεικνύει ότι η χρώση λειτούργησε, τα κύτταρα προσέλαβαν την αντιχρωστική και τα οπτικά μέσα ήταν επαρκή, χωρίς να λέει τίποτε για οργανισμούς κάτω από το όριο ανίχνευσης. Ένα μπλε πεδίο χωρίς ευρήματα είναι έγκυρο αποτέλεσμα για την πλάκα, όχι οριστικό συμπέρασμα για τον ασθενή.

Αν θυμάστε τον καταμερισμό των ρόλων, η διατύπωση των εκθέσεων γίνεται αυτονόητη. Η καρβολική φουξίνη εντοπίζει πιθανές μορφές ενδιαφέροντος. Η όξινη αλκοόλη εκτελεί τη δοκιμασία. Το κυανό του μεθυλενίου απλώς κάνει την απάντηση ευανάγνωστη: το κόκκινο συγκράτησε τη χρωστική παρά το οξύ, το μπλε την έχασε. Όλα τα υπόλοιπα, το είδος, το φορτίο και η κλινική σημασία, προκύπτουν από εργασία πέρα από την πλάκα.