Χρώση κυττάρων της παρειάς με κυανό του μεθυλενίου: τι να παρατηρήσετε

Μια μαθήτρια τοποθετεί μια σταγόνα εναιωρήματος κυττάρων της παρειάς σε μια αντικειμενοφόρο πλάκα, κοιτάζει στο μικροσκόπιο και δεν βλέπει σχεδόν τίποτα. Μερικές αχνές, σχεδόν άυλες μορφές μετακινούνται μέσα σε ένα φωτεινό πεδίο. Ρυθμίζει την εστίαση, αυξάνει τον φωτισμό και τελικά συμπεραίνει ότι η πλάκα είναι άδεια. Η πλάκα δεν είναι άδεια. Τα κύτταρα είναι εκεί. Είναι σχεδόν διαφανή, και αυτή η διαφάνεια είναι ακριβώς το πρόβλημα που καλείται να λύσει η συγκεκριμένη χρώση.

Αξίζει να επισημανθεί αυτή η αναντιστοιχία ανάμεσα στην προσδοκία και την εικόνα πριν αρχίσει το πρωτόκολλο. Οι αρχάριοι περιμένουν ότι ένα μικροσκόπιο θα αποκαλύψει λεπτομέρειες όπως το ζουμ μιας κάμερας αποκαλύπτει μια μακρινή πινακίδα. Ένα μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου κάνει κάτι πιο συγκεκριμένο: δείχνει διαφορές στην απορρόφηση του φωτός. Ένα άχρωμο κύτταρο της παρειάς δεν απορροφά σχεδόν καθόλου φως, οπότε δημιουργεί ελάχιστη διαφορά. Το κυανό του μεθυλενίου προσθέτει αυτή τη διαφορά. Δεσμεύεται ανομοιόμορφα στο εσωτερικό του κυττάρου και μετατρέπει τη δομή σε αντίθεση. Μόλις οι μαθητές κατανοήσουν αυτή την έννοια, κάθε επόμενο βήμα γίνεται αντιληπτό ως συνέπειά της και όχι ως συνταγή.

Εδώ βοηθά το θεωρητικό υπόβαθρο για το πώς οι απλές χρώσεις προσθέτουν αντίθεση στο σχολικό εργαστήριο, ενώ μια υπενθύμιση για τη ρύθμιση ενός μικροσκοπίου φωτεινού πεδίου πριν από τη χρώση αποτρέπει τις μισές αποτυχημένες παρασκευές. Η χημεία πίσω από το χρώμα παρουσιάζεται σε μια εισαγωγή στο κυανό του μεθυλενίου στη μικροσκοπία, η οποία εξηγεί γιατί αυτή η συγκεκριμένη χρωστική εμφανίζεται τόσο συχνά στον εργαστηριακό πάγκο.

Το πρωτόκολλο για τη σχολική τάξη

Το νωπό παρασκεύασμα που περιγράφεται παρακάτω είναι η απλούστερη βασική επιλογή για τα γενικά μαθήματα. Δεν απαιτεί φλόγα ούτε στάδιο μονιμοποίησης. Η παραλλαγή με μονιμοποιημένο επίχρισμα, που χρησιμοποιείται σε ορισμένα εγχειρίδια τριτοβάθμιας εκπαίδευσης, προσθέτει στέγνωμα στον αέρα και σύντομη θερμική μονιμοποίηση, όπως στη δραστηριότητα επιχρίσματος της παρειάς του North Central Texas College που δημοσιεύεται μέσω του Biology LibreTexts, αλλά η θερμική μονιμοποίηση είναι συνήθης πρακτική στη μικροβιολογία, όχι προϋπόθεση για την παρατήρηση επιθηλιακών κυττάρων.

Τι χρειάζεστε: καθαρές αντικειμενοφόρους πλάκες και καλυπτρίδες, αποστειρωμένους στυλεούς μίας χρήσης (κατά προτίμηση) ή καινούργιες επίπεδες οδοντογλυφίδες, ένα σταγονομετρικό φιαλίδιο με υδατικό διάλυμα κυανού του μεθυλενίου 0.5 έως 1 τοις εκατό, απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό, απορροφητικό χαρτί, γάντια και ένα σύνθετο μικροσκόπιο με συνολική μεγέθυνση 100x και 400x.

1. Ξεπλύνετε το στόμα με σκέτο νερό. Έτσι απομακρύνονται τα σωματίδια τροφής που αργότερα χρωματίζονται έντονα και αποσπούν την προσοχή από τα κύτταρα.
2. Κάθε μαθητής λαμβάνει δείγμα μόνο από τη δική του παρειά. Τρίψτε απαλά το εσωτερικό της παρειάς με έναν καινούργιο αποστειρωμένο στυλεό. Πιέστε, μην ξύνετε. Σταματήστε πολύ πριν εμφανιστεί οποιαδήποτε ενόχληση ή αιμορραγία.
3. Κυλήστε τον στυλεό στο κέντρο μιας καθαρής αντικειμενοφόρου πλάκας, σχηματίζοντας λεπτό στρώμα. Το λεπτό στρώμα είναι ο σημαντικότερος παράγοντας για ένα παρασκεύασμα που μπορεί να παρατηρηθεί καθαρά. Μια παχιά λευκή εναπόθεση θα χρωματιστεί και θα γίνει μια μπλε μάζα χωρίς διακριτές δομές.
4. Προσθέστε μία σταγόνα κυανού του μεθυλενίου πάνω στο επίχρισμα. Αφήστε τη για 1 έως 3 λεπτά. Ένα λεπτό αρκεί σε πολλά πρωτόκολλα τριτοβάθμιας εκπαίδευσης· το εγχειρίδιο εργαστηρίου φυσικών επιστημών της τάξης IX του NCERT προβλέπει περίπου 3 λεπτά για ένα προσωρινό παρασκεύασμα. Περισσότερος χρόνος δεν σημαίνει καλύτερο αποτέλεσμα, και η υπερβολική χρώση είναι το συχνότερο σφάλμα χρονισμού.
5. Ξεπλύνετε απαλά με απεσταγμένο νερό ή απομακρύνετε την περίσσεια χρωστικής με απορροφητικό χαρτί, σύμφωνα με το τοπικό πρωτόκολλο. Το φόντο πρέπει να γίνει ανοιχτό γαλάζιο, όχι βαθύ σκούρο μπλε.
6. Κατεβάστε την καλυπτρίδα υπό γωνία ώστε να ακουμπήσει πρώτα η μία άκρη και μετά αφήστε την να κατέβει αργά. Έτσι αποφεύγονται οι φυσαλίδες αέρα.
7. Ξεκινήστε με μικρή μεγέθυνση για να εντοπίσετε τα κύτταρα, επιβεβαιώστε την εστίαση και το κεντράρισμα και στη συνέχεια περάστε στα 100x και τελικά στα 400x. Στα 400x χρησιμοποιήστε μόνο τη μικρομετρική ρύθμιση εστίασης.

Η συγκέντρωση της χρωστικής χρειάζεται μια σύντομη διευκρίνιση. Τα σχολικά πρωτόκολλα χρησιμοποιούν συνήθως υδατικό διάλυμα κυανού του μεθυλενίου περίπου 1 τοις εκατό. Ένα πιο συμπυκνωμένο αρχικό διάλυμα ή η παρατεταμένη έκθεση σκουραίνει το φόντο ταχύτερα από τον πυρήνα, αντιστρέφοντας την αντίθεση στην οποία βασίζεται η άσκηση.

Ασφαλής χειρισμός υλικού από την παρειά

Τα δείγματα της παρειάς περιέχουν σάλιο και φυσιολογικούς μικροοργανισμούς του στόματος, επομένως αντιμετωπίστε κάθε νωπό επίχρισμα ως δυνητικά μολυσματικό υλικό, ακόμη κι αν οι δότες είναι υγιείς συμμαθητές. Οι οδηγίες βιοασφάλειας της Αμερικανικής Εταιρείας Μικροβιολογίας για εκπαιδευτικά εργαστήρια ορίζουν τις γενικές αρχές: εκτίμηση κινδύνου πριν από το μάθημα, χρήση γαντιών, προστασία των ματιών όπου υπάρχει πιθανότητα πιτσιλίσματος, πλύσιμο των χεριών μετά, απολύμανση των πάγκων και απόρριψη των μολυσμένων υλικών μίας χρήσης μέσω της εγκεκριμένης διαδικασίας διαχείρισης βιολογικών αποβλήτων.

Τέσσερις κανόνες στην τάξη καλύπτουν το μεγαλύτερο μέρος του κινδύνου. Ένας δότης ανά στυλεό και ανά πλάκα, χωρίς κοινή χρήση. Λήψη δείγματος μόνο από τον ίδιο τον μαθητή, ποτέ από τον διπλανό του. Οι στυλεοί και οι οδοντογλυφίδες μίας χρήσης μπαίνουν απευθείας στον καθορισμένο περιέκτη αποβλήτων, ποτέ ξανά στον πάγκο. Το ίδιο το κυανό του μεθυλενίου λεκιάζει το δέρμα και τα ρούχα και ερεθίζει τα μάτια, οπότε απαιτούνται γάντια και οι συνήθεις κανόνες υγιεινής κατά τον χειρισμό χρωστικών. Μην επεκτείνετε την άσκηση σε καλλιέργεια οποιουδήποτε υλικού από το επίχρισμα και μην αυτοσχεδιάζετε με θερμική μονιμοποίηση νωπού ανθρώπινου υλικού εκτός της διαδικασίας ασφάλειας του σχολείου.

Τι να παρατηρήσετε και γιατί έχει αυτή την εμφάνιση

Στα 100x, αναζητήστε πλατιά, επίπεδα κύτταρα, ανοιχτά γαλάζια, με ακανόνιστο ωοειδές ή πολυγωνικό περίγραμμα. Βρίσκονται μεμονωμένα ή σε χαλαρές, αλληλεπικαλυπτόμενες στιβάδες. Κάθε κύτταρο έχει συνήθως μία πιο σκούρα μπλε κηλίδα. Αυτή η κηλίδα είναι ο πυρήνας. Παρατηρήστε και τη διάταξή τους: τα πλακώδη επιθηλιακά κύτταρα μοιάζουν με λεπτά πλακίδια, όχι με σφαίρες, γι’ αυτό τα όριά τους θυμίζουν ραγισμένη εφυάλωση και όχι στρογγυλά μπαλόνια.

Στα 400x, διακρίνονται καθαρά τρία χαρακτηριστικά. Το όριο του κυττάρου εμφανίζεται ως μια λεπτή, πιο σκούρα γραμμή που το περιβάλλει. Το κυτταρόπλασμα γεμίζει το εσωτερικό με ένα ανοιχτό, ομοιόμορφο γαλάζιο χρώμα. Ο πυρήνας είναι πιο σκούρος και πιο συμπαγής, συχνά ωοειδής, συνήθως κοντά στο κέντρο αλλά όχι πάντα. Ζητήστε από τους μαθητές να καταγράψουν και τα τρία, μαζί με το σχήμα και τη μεγέθυνση, επειδή το φύλλο εργασίας ζητά ακριβώς αυτά.

Εδώ έχει σημασία μια διευκρίνιση ακρίβειας, την οποία πολλά φύλλα εργασίας παρουσιάζουν λανθασμένα. Το ορατό όριο αντιστοιχεί στην περιοχή της πλασματικής μεμβράνης, αλλά η ίδια η μεμβράνη, μια λιπιδική διπλοστιβάδα πάχους περίπου 7 έως 10 νανομέτρων, βρίσκεται πολύ κάτω από το όριο διακριτικής ικανότητας ενός σχολικού μικροσκοπίου. Αυτό που βλέπουν οι μαθητές είναι το οπτικό περίγραμμα του κυττάρου μαζί με τη χρωστική που έχει συσσωρευτεί εκεί. Η ίδια επιφύλαξη ισχύει για τα οργανίδια. Τα μιτοχόνδρια, το ενδοπλασματικό δίκτυο, τα σωμάτια Golgi και τα ριβοσώματα δεν διακρίνονται σε αυτό το παρασκεύασμα. Ένα συμβατικό οπτικό μικροσκόπιο διακρίνει δομές μέχρι περίπου 0.2 μικρόμετρα υπό καλές συνθήκες, όπως εξηγεί το υλικό κυτταρικής βιολογίας του NCBI για τα εργαλεία μικροσκοπίας, και το μεγαλύτερο μέρος της υπερδομής βρίσκεται κάτω από αυτό το όριο ή κοντά του. Η μεγαλύτερη κενή μεγέθυνση αυξάνει το μέγεθος της εικόνας χωρίς να προσθέτει λεπτομέρεια.

Γιατί ο πυρήνας χρωματίζεται πιο σκούρα; Το κυανό του μεθυλενίου είναι κατιονική χρωστική, θετικά φορτισμένη σε διάλυμα, και συνδέεται με αρνητικά φορτισμένο υλικό μέσα στο κύτταρο, κυρίως με νουκλεϊκά οξέα. Η χρωματίνη συγκεντρώνει DNA στον πυρήνα, οπότε ο πυρήνας συγκεντρώνει την περισσότερη χρωστική. Το κυτταρόπλασμα περιέχει RNA και άλλα φορτισμένα μόρια, επομένως χρωματίζεται και αυτό, αλλά πιο διάχυτα και πιο ανοιχτά. Η βασική διευκρίνιση: το κυανό του μεθυλενίου δεν είναι χρωστική ειδική για το DNA. Έρευνα για την κατανομή του κυανού του μεθυλενίου στην απεικόνιση του πυρήνα περιγράφει τη σύνδεση του κατιόντος με περιοχές πλούσιες σε νουκλεϊκά οξέα, ενώ παλαιότερη ποσοτική έρευνα για τη δέσμευση του κυανού του μεθυλενίου σε κυτταρικά παρασκευάσματα διαπίστωσε ότι το μεγαλύτερο μέρος της δεσμευμένης χρωστικής συνδεόταν με νουκλεϊκά οξέα. Ο σκούρος πυρήνας και το ανοιχτό κυτταρόπλασμα αποτελούν επομένως ένα πρότυπο αντίθεσης, όχι μια μοριακή δοκιμασία.

Λάθη που θα κάνουν οι μαθητές και πώς να τα ερμηνεύσετε

Σχεδόν κάθε αποτυχημένο παρασκεύασμα εντάσσεται σε ένα από πέντε μοτίβα. Διδάξτε τους μαθητές να εντοπίζουν το πρόβλημα στο παρασκεύασμα αντί να επαναλαμβάνουν τυφλά τη διαδικασία.

Η υπερβολική χρώση κάνει τα κύτταρα και το φόντο ομοιόμορφα σκούρα, με αποτέλεσμα ο πυρήνας να μη διακρίνεται μέσα στο πεδίο. Διορθώστε το με μικρότερο χρόνο χρώσης ή πιο σχολαστικό ξέπλυμα. Η ανεπαρκής χρώση αφήνει αχνές μορφές που εξαφανίζονται όταν αυξάνεται ο φωτισμός· αυξήστε τον χρόνο κατά διαστήματα τριάντα δευτερολέπτων. Τα παχιά επιχρίσματα δημιουργούν πυκνές αλληλεπικαλυπτόμενες μάζες όπου δεν μπορεί να διακριθεί κανένα περίγραμμα· η διόρθωση είναι μηχανική: απλώστε λεπτότερο στρώμα την επόμενη φορά, καθώς κανένα ξέπλυμα δεν μπορεί να διορθώσει έναν σωρό κυττάρων. Οι φυσαλίδες αέρα εμφανίζονται ως τέλειοι κύκλοι με σαφή, σκούρα περιγράμματα και αποσπούν την προσοχή των αρχαρίων, που τις εκλαμβάνουν ως δομές· επανατοποθετήστε την καλυπτρίδα αργά και υπό γωνία. Οι μικροσκοπικές σκούρες κουκκίδες που είναι διάσπαρτες πάνω ή γύρω από τα κύτταρα είναι συνήθως φυσιολογικά βακτήρια του στόματος, όπως σημειώνουν σχολικά πρωτόκολλα, για παράδειγμα η διαδικασία παρατήρησης κυττάρων της παρειάς του Ingrid Science. Επιβεβαιώνουν ότι το στόμα φιλοξενεί μικροοργανισμούς, κάτι που μπορεί να μείνει στη μνήμη των μαθητών, αλλά δεν μπορούν να ταυτοποιηθούν σε επίπεδο είδους σε αυτή την άσκηση και δεν πρέπει να σχεδιάζονται ως μέρη του κυττάρου. Τα υπολείμματα τροφής και τα νήματα βλέννας χρωματίζονται ανομοιόμορφα και έντονα· το αρχικό ξέπλυμα γίνεται για να μειωθούν.

Τι δεν μπορεί να κάνει αυτή η άσκηση

Πρόκειται για εκπαιδευτική παρατήρηση, όχι για διαγνωστική εξέταση. Κανένα στοιχείο της εμφάνισης των κυττάρων σε μια σχολική χρώση δεν μπορεί να διαγνώσει λοίμωξη, καρκίνο ή οποιαδήποτε νόσο, και το άρθρο δεν πρέπει να εκληφθεί ως υπόδειξη για κάτι τέτοιο. Το παρασκεύασμα δείχνει το σχήμα, το όριο, το κυτταρόπλασμα και τον πυρήνα σε δύο μεγεθύνσεις. Δεν δείχνει την υπερδομή της μεμβράνης, λεπτομέρειες των οργανιδίων ή τη μοριακή ταυτότητα. Η σαφής διατύπωση αυτού του περιορισμού προστατεύει τόσο την επιστημονική ακρίβεια όσο και τους μαθητές: ένα καλό αποτέλεσμα είναι ένα σωστά επισημασμένο σχέδιο με καταγεγραμμένη τη μεγέθυνση και τη χρωστική, όχι ένα συμπέρασμα για την υγεία.

Φύλλο εργασίας μαθητή και μικροφωτογραφίες με επισημάνσεις

Τα δύο υλικά της δραστηριότητας για αυτή τη σελίδα είναι η παραπάνω μικροφωτογραφία με επισημάνσεις και το παρακάτω φύλλο εργασίας. Εκτυπώστε ένα φύλλο εργασίας ανά μαθητή ή προβάλετέ το και ζητήστε από τους μαθητές να αντιγράψουν τα πλαίσια στα τετράδιά τους.

Πώς να το χρησιμοποιήσετε σε ένα μάθημα 45 λεπτών: δέκα λεπτά για ενημέρωση ασφάλειας και λήψη δειγμάτων, δέκα λεπτά για χρώση και προετοιμασία του παρασκευάσματος, δεκαπέντε λεπτά για παρατήρηση και σχεδίαση και στις δύο μεγεθύνσεις, δέκα λεπτά για τη λίστα ελέγχου και τη σύγκριση με τη μικροφωτογραφία με επισημάνσεις. Τα σημεία της λίστας ελέγχου είναι σκόπιμα πρακτικά. Λεπτό επίχρισμα, σωστός χρόνος χρώσης, πυρήνας πιο σκούρος από το κυτταρόπλασμα, καταγεγραμμένη μεγέθυνση. Ένας μαθητής που μπορεί να σημειώσει και τα τέσσερα έχει κατανοήσει την έννοια που έχει στόχο να διδάξει το μάθημα: τα μικροσκόπια αναδεικνύουν διαφορές και οι χρώσεις δημιουργούν τις διαφορές που αξίζει να αναδειχθούν.