Απλή χρώση με κυανό του μεθυλενίου έναντι χρώσης Gram: τι μπορεί να αποδείξει κάθε μέθοδος

Ένας φοιτητής προετοιμάζει ένα επίχρισμα από καλλιέργεια με την ετικέτα E. coli, το καλύπτει με κυανό του μεθυλενίου για ένα λεπτό, το ξεπλένει και το παρατηρεί με τον αντικειμενικό φακό εμβάπτισης σε έλαιο. Μπλε ραβδία καλύπτουν το οπτικό πεδίο. Η εργαστηριακή αναφορά γράφει: «Gram-αρνητικά ραβδία ταυτοποιήθηκαν ως E. coli.» Η παρατήρηση είναι σωστή. Το συμπέρασμα δεν τεκμηριώνεται από αυτό το παρασκεύασμα.

Το σφάλμα είναι εννοιολογικό, όχι τεχνικό. Ο φοιτητής αντιμετώπισε μια απλή χρώση σαν να ήταν διαφορική δοκιμασία. Η απλή χρώση και η χρώση Gram απαντούν σε διαφορετικά ερωτήματα επειδή βασίζονται σε διαφορετικές αρχές χρώσης. Η μία ρωτά: ποιο σχήμα υπάρχει. Η άλλη ρωτά: πώς συμπεριφέρεται το κυτταρικό τοίχωμα όταν υποβάλλεται σε δοκιμασία. Αν συγχέετε τις δύο, ένα σωστά χρωματισμένο παρασκεύασμα οδηγεί σε ατεκμηρίωτη αναφορά.

Αυτή η σύγκριση διαχωρίζει τις δύο μεθόδους, δείχνει τι σας επιτρέπει να υποστηρίξετε κάθε αποτέλεσμα και απαντά στα δύο ερωτήματα που θέτουν συχνότερα οι φοιτητές: μπορεί το κυανό του μεθυλενίου να χρησιμοποιηθεί στη χρώση Gram και τι δείχνει πραγματικά η χρώση του E. coli με κυανό του μεθυλενίου.

Η σύντομη απάντηση

Η απλή χρώση με κυανό του μεθυλενίου χρωματίζει κάθε κύτταρο που μπορεί να χρωματιστεί με το ίδιο μπλε χρώμα. Επομένως, αποκαλύπτει τη μορφολογία (ραβδία, σφαίρες, σπείρες) και τη διάταξη (μεμονωμένα κύτταρα, ζεύγη, αλυσίδες), αλλά τίποτα για την κατηγορία Gram. Η χρώση Gram προσθέτει ιώδιο, ένα στάδιο αποχρωματισμού και μια αντιχρώση, ώστε να διαχωρίζει τα βακτήρια σε Gram-θετικά (μοβ) και Gram-αρνητικά (ροζ ή κόκκινα), ανάλογα με το πώς τα κυτταρικά τους περιβλήματα συγκρατούν τη χρωστική. Τα μπλε ραβδία μετά τη χρώση με κυανό του μεθυλενίου σημαίνουν «υπάρχουν κύτταρα με ραβδοειδές σχήμα». Τα ροζ ραβδία μετά από μια πλήρη ακολουθία χρώσης Gram σημαίνουν «υπάρχουν Gram-αρνητικά ραβδία». Η δεύτερη δήλωση έχει ισχυρότερη τεκμηρίωση επειδή η διαδικασία περιλάμβανε μια πρόσθετη δοκιμασία.

Για την ευρύτερη οικογένεια μεθόδων χρώσης βακτηρίων με μία χρωστική, στην οποία εντάσσεται αυτό το άρθρο, δείτε τον άτλαντα χρώσεων μικροσκοπίας.

Απλή χρώση: μία χρωστική, ένα ερώτημα

Το κυανό του μεθυλενίου είναι βασική (κατιονική) χρωστική. Το έγχρωμο ιόν του φέρει θετικό φορτίο και δεσμεύεται σε αρνητικά φορτισμένες δομές του κυττάρου, όπως τα νουκλεϊκά οξέα και οι όξινες ομάδες της επιφάνειας. Έτσι, τα κύτταρα εμφανίζονται μπλε σε ανοιχτόχρωμο υπόβαθρο. Το OpenStax περιγράφει αυτή την αρχή θετικής χρώσης στο κεφάλαιό του για τις χρώσεις. Το ίδιο το κατιόν της χρωστικής είναι το μικρό, επίπεδο ιόν φαινοθειαζίνης που περιγράφεται αναλυτικά στο άρθρο αναφοράς για τη χημεία του κυανού του μεθυλενίου· το αντισταθμιστικό ιόν χλωριδίου δεν προκαλεί τον χρωματισμό.

Ένα τυπικό εκπαιδευτικό πρωτόκολλο είναι σκόπιμα απλό: παρασκευάστε ένα λεπτό επίχρισμα, αφήστε το να στεγνώσει στον αέρα, μονιμοποιήστε το με θέρμανση, καλύψτε το με υδατικό διάλυμα κυανού του μεθυλενίου περίπου 1% για περίπου ένα λεπτό, ξεπλύνετε απαλά με νερό, στεγνώστε το ταμποναριστά και εξετάστε το με εμβάπτιση σε έλαιο. Ένα εκπαιδευτικό πρωτόκολλο του LibreTexts δίνει ακριβώς αυτή τη διαδικασία με διάλυμα 1% για ένα λεπτό, επισημαίνοντας παράλληλα ότι ορισμένα εργαστήρια παρατείνουν τον χρόνο. Χωρίς προστυπτικό, χωρίς αποχρωματιστικό, χωρίς δεύτερη χρωστική. Αυτή η απουσία είναι το ουσιώδες στοιχείο. Με μία μόνο χρωστική και χωρίς επιλεκτική αφαίρεσή της, κάθε κύτταρο που δεσμεύει τη χρωστική καταλήγει με το ίδιο χρώμα.

Στην περίπτωση του E. coli, το αναμενόμενο πεδίο περιλαμβάνει μπλε ραβδία (βακίλλους), μεμονωμένα, σε ζεύγη ή σε μικρές ομάδες. Το μπλε χρώμα προέρχεται από τη χρωστική. Το ραβδοειδές σχήμα προέρχεται από τον οργανισμό. Ο συνδυασμός, όμως, δεν ταυτοποιεί τον οργανισμό, επειδή πολλά είδη έχουν ραβδοειδές σχήμα και πολλά ραβδία χρωματίζονται μπλε με απλή χρώση. Η ATCC διατυπώνει ρητά αυτόν τον περιορισμό στη μορφολογία στον οδηγό της για μικροβιολογικές καλλιέργειες. Μια σωστή αναφορά γράφει: «Παρατηρήθηκαν μπλε βάκιλλοι.» Οτιδήποτε πέρα από το σχήμα και τη διάταξη χρειάζεται περισσότερα στοιχεία.

Χρώση Gram: τέσσερα αντιδραστήρια, μία δοκιμασία συμπεριφοράς

Η χρώση Gram είναι διαφορική χρώση. Υποβάλλει όλα τα κύτταρα στην ίδια ακολουθία και δείχνει ποια συγκρατούν την πρώτη χρωστική και ποια τη χάνουν. Τα πρωτόκολλα χρώσης Gram της Αμερικανικής Εταιρείας Μικροβιολογίας ορίζουν την τυπική σειρά τεσσάρων βημάτων: κρυσταλλικό ιώδες (πρωτογενής χρωστική), ιώδιο Gram (προστυπτικό), αλκοόλη ή μείγμα ακετόνης και αλκοόλης (αποχρωματιστικό) και, τέλος, σαφρανίνη (χρωστική αντιχρώσης).

Το τυπικό εκπαιδευτικό μοντέλο εξηγεί τον διαχωρισμό μέσω της δομής του κυτταρικού περιβλήματος. Τα Gram-θετικά κύτταρα έχουν παχύ τοίχωμα πεπτιδογλυκάνης, το οποίο αφυδατώνεται και συγκρατεί το σύμπλοκο κρυσταλλικού ιώδους και ιωδίου κατά την έκπλυση με αλκοόλη. Τα Gram-αρνητικά κύτταρα έχουν λεπτό στρώμα πεπτιδογλυκάνης και μια εξωτερική μεμβράνη πλούσια σε λιπίδια, την οποία διαταράσσει το αποχρωματιστικό. Έτσι, το σύμπλοκο απομακρύνεται με την έκπλυση και τα κύτταρα προσλαμβάνουν στη συνέχεια σαφρανίνη. Η ανασκόπηση για τη χρώση Gram στο NCBI Bookshelf δίνει αυτή την εξήγηση με βάση το κυτταρικό τοίχωμα. Οι ειδικοί προσθέτουν ότι η συνολική φυσικοχημεία είναι πιο σύνθετη από το πάχος του τοιχώματος και μόνο, αλλά για την ερμηνεία στον εργαστηριακό πάγκο ισχύει ο κανόνας της συμπεριφοράς: το μοβ σημαίνει συγκράτηση, το ροζ σημαίνει απώλεια και στη συνέχεια αντιχρώση.

Ενδεικτικές εικόνες. Στυλιζαρισμένα σχέδια για σύγκριση μεθόδων, όχι μικροφωτογραφίες από κάμερα. Τα χρώματα είναι απλοποιημένα για να διδαχθεί η λογική: ένα χρώμα στην απλή χρώση, δύο χρώματα μετά τον αποχρωματισμό Gram.

Μπορεί το κυανό του μεθυλενίου να χρησιμοποιηθεί στη χρώση Gram

Αυτό το ερώτημα έχει δύο ερμηνείες, που χρειάζονται διαφορετικές απαντήσεις.

Πρώτη ερμηνεία: μπορεί μία μόνο κάλυψη με κυανό του μεθυλενίου να αντικαταστήσει ολόκληρη την ακολουθία Gram. Όχι. Χωρίς ιώδιο, αποχρωματιστικό και αντιχρώση δεν υπάρχει διαφορικό στάδιο, επομένως δεν ελέγχεται καμία κατηγορία Gram. Ένα μπλε πεδίο μετά τη χρήση μόνο κυανού του μεθυλενίου είναι αποτέλεσμα απλής χρώσης, ακόμη κι αν η φιάλη βρίσκεται δίπλα στα αντιδραστήρια Gram. Μην το καταγράφετε ως αποτέλεσμα Gram.

Δεύτερη ερμηνεία: μπορεί το κυανό του μεθυλενίου να αντικαταστήσει τη σαφρανίνη ως χρωστική αντιχρώσης στο βήμα 4. Λειτουργικά, μπορεί να χρωματίσει τα αποχρωματισμένα κύτταρα, και μια άσκηση εγχειριδίου προβλέπει μοβ Gram-θετικά κύτταρα και μπλε Gram-αρνητικά κύτταρα μετά από μια τέτοια αντικατάσταση. Η λογική είναι ορθή επειδή τα σωστά αποχρωματισμένα Gram-αρνητικά κύτταρα είναι σχεδόν άχρωμα και θα προσλάβουν μια άλλη κατιονική χρωστική. Όμως, αυτό δεν είναι το τυπικό πρωτόκολλο. Τα πρωτόκολλα της ASM καθορίζουν τη σαφρανίνη, με αναγνωρισμένες εναλλακτικές, όπως η βασική φουξίνη σε ορισμένες παραλλαγές, όχι το κυανό του μεθυλενίου. Υπάρχει επίσης ένα πρακτικό μειονέκτημα: το μπλε διακρίνεται δυσκολότερα από το μοβ σε σύγκριση με το ροζ, ιδιαίτερα για αρχάριους και ειδικά όταν οι λυχνίες του μικροσκοπίου έχουν εξασθενήσει. Για εκπαιδευτικές εργασίες και για κάθε αποτέλεσμα που έχει σημασία, χρησιμοποιήστε τη χρωστική αντιχρώσης που ορίζει το πρωτόκολλό σας, συνήθως τη σαφρανίνη, και αντιμετωπίστε την αντιχρώση με κυανό του μεθυλενίου ως παραλλαγή επίδειξης και όχι ως ισοδύναμη τυπική μέθοδο.

Το σχετικό ερώτημα για το πώς συγκρίνεται το κυανό του μεθυλενίου με άλλες επιλογές μίας χρωστικής καλύπτεται σε μια σύγκριση απλών χρώσεων βακτηρίων.

Τι αποδεικνύει η χρώση του E. coli με κυανό του μεθυλενίου και τι όχι

Το E. coli είναι Gram-αρνητικό ραβδίο, αλλά αυτή η πρόταση συνδυάζει στοιχεία από διάφορες μεθόδους: τη μορφολογία από τη μικροσκοπία, την αντίδραση Gram από τη χρώση Gram και την ταυτότητα από καλλιέργεια σε συνδυασμό με βιοχημικές ή μοριακές δοκιμασίες. Ένα επίχρισμα με κυανό του μεθυλενίου συνεισφέρει μόνο το πρώτο μέρος. Τεκμηριώνει ότι στο χρωματισμένο δείγμα υπάρχουν κύτταρα με ραβδοειδές σχήμα και δείχνει πώς είναι διατεταγμένα. Δεν τεκμηριώνει την αντίδραση Gram, επειδή δεν πραγματοποιήθηκε δοκιμασία αποχρωματισμού. Δεν ταυτοποιεί το είδος, επειδή τα ραβδία πολλών ειδών μοιάζουν μεταξύ τους σε αυτή τη διακριτική ικανότητα.

Σε αυτό το σημείο οι αναφορές οδηγούνται σε σφάλμα με προβλέψιμο τρόπο. Ο συντάκτης μεταφέρει προϋπάρχουσες γνώσεις («αυτή η καλλιέργεια υποτίθεται ότι είναι E. coli, και το E. coli είναι Gram-αρνητικό») στη γραμμή της παρατήρησης. Έτσι, το παρασκεύασμα φαίνεται να επιβεβαιώνει κάτι που στην πραγματικότητα απλώς θεωρήθηκε δεδομένο. Μια σαφέστερη αναφορά διαχωρίζει τα επίπεδα: «Απλή χρώση με κυανό του μεθυλενίου: παρατηρήθηκαν μπλε βάκιλλοι· μόνο μορφολογία, δεν ελέγχθηκε κατηγορία Gram.» Έπειτα, εφόσον η χρώση Gram πραγματοποιήθηκε σωστά με μάρτυρες: «Χρώση Gram: ροζ ραβδία, εύρημα συμβατό με Gram-αρνητικά.» Η ταυτότητα του είδους προκύπτει αργότερα, από τη διαδικασία ταυτοποίησης, όχι μόνο από το χρώμα.

Ένας πρακτικός οδηγός ερμηνείας

Χρησιμοποιήστε αυτόν τον κανόνα απόφασης στον εργαστηριακό πάγκο. Αν όλα τα κύτταρα έχουν ένα χρώμα και το πρωτόκολλο χρησιμοποίησε μία χρωστική χωρίς αποχρωματιστικό, πραγματοποιήσατε απλή χρώση. Αναφέρετε το σχήμα, μια εκτίμηση μεγέθους και τη διάταξη. Σταματήστε εκεί. Αν το πρωτόκολλο περιλάμβανε κρυσταλλικό ιώδες, ιώδιο, αποχρωματιστικό και αντιχρώση, με γνωστούς θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες, πραγματοποιήσατε χρώση Gram. Αναφέρετε το χρώμα μαζί με τη μορφολογία: μοβ κόκκοι σε αλυσίδες, ροζ ραβδία και ούτω καθεξής.

Τρία λάθη ευθύνονται για το μεγαλύτερο μέρος της σύγχυσης. Πρώτον, η υπερερμηνεία των μπλε ραβδίων ως επιβεβαίωσης του E. coli. Δεύτερον, η καταχώριση ενός παρασκευάσματος με κυανό του μεθυλενίου κάτω από την επικεφαλίδα «Χρώση Gram» σε ένα σημειωματάριο, κάτι που οι μελλοντικοί αναγνώστες θα παρερμηνεύσουν. Τρίτον, η πρόχειρη αντικατάσταση χρωστικών αντιχρώσης και η μετέπειτα σύγκριση χρωμάτων μεταξύ εργαστηρίων σαν να χρησιμοποιούσαν τις ίδιες χρωματικές παλέτες. Κάθε λάθος έχει την ίδια διόρθωση: κατονομάστε τη μέθοδο που πράγματι πραγματοποιήθηκε και υποστηρίξτε μόνο όσα ελέγχει αυτή η μέθοδος.

Η απλή χρώση έχει τη θέση της ακριβώς επειδή οι ισχυρισμοί που επιτρέπει είναι περιορισμένοι. Είναι γρήγορη, ανεκτική σε μικρές αποκλίσεις και επαρκής όταν το ερώτημα αφορά τη μορφολογία: υπάρχει κάτι και τι σχήμα έχει. Όταν το ερώτημα αφορά την ταξινόμηση, πραγματοποιήστε τη διαφορική δοκιμασία. Το μπλε παρασκεύασμα σας δείχνει πώς μοιάζουν τα κύτταρα. Το μοβ ή ροζ παρασκεύασμα σας δείχνει πώς συμπεριφέρονται τα τοιχώματά τους. Κανένα παρασκεύασμα, από μόνο του, δεν σας αποκαλύπτει το είδος.