Οι χρώσεις με αλκαλικό κυανό του μεθυλενίου κατά Loeffler και πολυχρωμικό κυανό του μεθυλενίου

Τρεις φιάλες μπορεί να βρίσκονται δίπλα δίπλα σε έναν πάγκο χρώσεων, καθεμία με ετικέτα που αναφέρει κάποια παραλλαγή του κυανού του μεθυλενίου. Η μία γράφει υδατικό κυανό του μεθυλενίου 1%. Η άλλη γράφει αλκαλικό κυανό του μεθυλενίου κατά Loeffler. Η τρίτη γράφει πολυχρωμικό κυανό του μεθυλενίου. Ένας πολυάσχολος εργαζόμενος πιάνει όποια βρίσκεται πιο κοντά. Το επίχρισμα στη συνέχεια χρωματίζεται υπερβολικά αχνά, υπερβολικά ομοιόμορφα μπλε ή σε απροσδόκητες αποχρώσεις του μωβ, και το αποτέλεσμα αποδίδεται σε πρόβλημα του δείγματος.

Το πρόβλημα αφορά τη σύνθεση, όχι το δείγμα. Τα τρία διαλύματα περιέχουν συγγενικές χρωστικές, αλλά βασίζονται σε διαφορετικές αρχές χρώσης. Το ένα είναι μια απλή κατιονική χρωστική με σχεδόν ουδέτερο pH. Το άλλο είναι η ίδια χρωστική, με ενισχυμένη δράση λόγω αλκάλεως. Το τρίτο δεν είναι πλέον μία μόνο χρωστική, αλλά ένα μείγμα που έχει οξειδωθεί σκόπιμα. Αν χρησιμοποιήσετε το λάθος διάλυμα, αλλάζει η αρχή της χρώσης που εφαρμόζετε.

Η σύντομη απάντηση

Το απλό υδατικό κυανό του μεθυλενίου αποτελεί τη βάση αναφοράς: περίπου 1% χρωστική σε νερό, μια απλή κατιονική χρωστική για τη μορφολογία των βακτηρίων και τη γενική μικροσκοπία. Στο αλκαλικό κυανό του μεθυλενίου κατά Loeffler προστίθεται μια μικρή, μετρημένη ποσότητα αραιού αλκάλεως σε αλκοολικό μητρικό διάλυμα που αραιώνεται με νερό. Έτσι αυξάνεται το pH και ενισχύεται η πρόσδεση της κατιονικής χρωστικής στις όξινες δομές των βακτηρίων. Το πολυχρωμικό κυανό του μεθυλενίου είναι κυανό του μεθυλενίου που έχει υποστεί σκόπιμη ωρίμανση μέσω οξείδωσης σε αλκαλικό περιβάλλον. Η φιάλη επομένως περιέχει ένα μείγμα απομεθυλιωμένων ομολόγων (azure A, azure B, azure C), θειονίνης και ιώδους του μεθυλενίου, μαζί με υπολειμματικό κυανό του μεθυλενίου, και αυτό το μείγμα χρωματίζει διαφορετικές δομές με διαφορετικές αποχρώσεις.

Αν θυμάστε μόνο μία πρόταση: η αλκαλοποίηση αλλάζει την ένταση της χρώσης, ενώ ο πολυχρωματισμός αλλάζει τα χρώματά της.

Απλό υδατικό κυανό του μεθυλενίου: το σημείο αναφοράς

Η απλούστερη σύνθεση είναι κυανό του μεθυλενίου διαλυμένο σε νερό, συνήθως σε συγκέντρωση 1% w/v, χωρίς άλκαλι και χωρίς οξείδωση. Το έγχρωμο χημικό είδος είναι το κατιόν μεθυλοθειονινίου με χλωριούχο αντιιόν, μια μικρή, επίπεδη χρωστική φαινοθειαζίνης που περιγράφεται στην καταχώριση του PubChem για το κυανό του μεθυλενίου ως χλωριούχο μεθυλοθειονίνιο. Ως κατιόν, προσδένεται στον φωσφορικό σκελετό των νουκλεϊκών οξέων και στις όξινες ομάδες των βακτηριακών κυτταρικών τοιχωμάτων, χρωματίζοντας τα κύτταρα μπλε σε ανοιχτόχρωμο υπόβαθρο.

Το πλεονέκτημά του είναι η προβλεψιμότητα. Οι πυρήνες και τα βακτήρια εμφανίζονται μπλε. Η αντίθεση είναι μέτρια. Οι δυσδιάκριτοι μικροοργανισμοί μπορεί να χρωματίζονται ασθενώς, και αυτός είναι ακριβώς ο περιορισμός που επιδίωξε να αντιμετωπίσει ο Loeffler. Για την ευρύτερη οικογένεια απλών βακτηριακών χρώσεων στην οποία ανήκει αυτό το διάλυμα, δείτε μια επισκόπηση της απλής χρώσης βακτηρίων. Η προσεκτική εξακρίβωση της ταυτότητας παραμένει σημαντική και εδώ: το κυανό του μεθυλίου είναι ένα εντελώς διαφορετικό μόριο, όπως εξηγείται στη σύγκριση κυανού του μεθυλίου και κυανού του μεθυλενίου, οπότε μια αναζήτηση σε κατάλογο μόνο με βάση την ονομασία του χρώματος μπορεί να οδηγήσει σε λάθος κατηγορία χρωστικής.

Αλκαλικό κυανό του μεθυλενίου κατά Loeffler: η ίδια χρωστική, με ενισχυμένη δράση

Η κλασική συνταγή του Loeffler συνδυάζει ένα αλκοολικό μητρικό διάλυμα κυανού του μεθυλενίου με αραιό άλκαλι σε νερό. Οι εκδοχές των εγχειριδίων προβλέπουν 0.3 g χρωστικής σε 30 mL αιθανόλης 95%, μαζί με 100 mL υδατικού διαλύματος υδροξειδίου του καλίου 0.01% (ή, ισοδύναμα, 30 mL κορεσμένου αλκοολικού διαλύματος κυανού του μεθυλενίου, 100 mL απεσταγμένου νερού και 1 mL KOH 1%), δίνοντας ένα διάλυμα εργασίας με περίπου 0.3% χρωστική και σαφώς αλκαλικό pH. Οι εμπορικές εκδοχές ακολουθούν την ίδια αρχή, και ο κατάλογος χρωστικών μικροβιολογίας της Thermo Fisher παραθέτει το αλκαλικό κυανό του μεθυλενίου κατά Loeffler μαζί με την πολυχρωμική και την υδατική παραλλαγή ως ξεχωριστά είδη καταλόγου, με διαφορετικές προβλεπόμενες χρήσεις.

Το άλκαλι είναι το βασικό στοιχείο της μεθόδου. Η αύξηση του pH αποπρωτονιώνει τις καρβοξυλικές και φωσφορικές ομάδες του παρασκευάσματος, αυξάνοντας την πυκνότητα των αρνητικά φορτισμένων θέσεων. Παράλληλα, το μητρικό διάλυμα αιθανόλης διατηρεί τη χρωστική πλήρως διαλυμένη, ώστε να φτάνει σε αυτές τις θέσεις σε μονομερή μορφή. Το αποτέλεσμα είναι ταχύτερη και εντονότερη χρώση των βακτηρίων σε σχέση με την ουδέτερη υδατική χρωστική, με τα χαρακτηριστικά βαθυγάλαζα βακτήρια σε μορφή βακίλων και κόκκων ενός συνηθισμένου βακτηριολογικού επιχρίσματος. Ο χρόνος χρώσης είναι συνήθως ένα έως τρία λεπτά και ακολουθεί έκπλυση με νερό.

Η κλασική εφαρμογή είναι το Corynebacterium diphtheriae που έχει αναπτυχθεί σε θρεπτικό υλικό ορού Loeffler: λεπτοί βάκιλοι, συχνά ροπαλοειδείς, με έντονα χρωματισμένα μεταχρωματικά κοκκία Babes-Ernst από αποθηκευμένο πολυφωσφορικό. Ο συνδυασμός θρεπτικού υλικού και χρωστικής έχει ιστορική προέλευση, καθώς και τα δύο αποδίδονται στον ίδιο βακτηριολόγο, ενώ η αντίθεση των κοκκίων αποτελεί το διαγνωστικό όφελος. Πέρα από τις εργασίες που αφορούν τη διφθερίτιδα, η χρωστική χρησιμοποιείται ως γενική βακτηριολογική χρωστική για επιχρίσματα καλλιεργειών, για τη μορφολογία της Neisseria σε κλινικά επιχρίσματα και όπου δεν χρειάζεται χρώση Gram, αλλά το απλό υδατικό κυανό δίνει πολύ αχνό αποτέλεσμα. Πρόκειται για μονοχρωματική χρώση. Κάθε όξινη δομή παίρνει κάποια απόχρωση του μπλε. Όταν ένα πρωτόκολλο απαιτεί διαφοροποίηση μέσω χρώματος, το άλκαλι από μόνο του δεν μπορεί να την προσφέρει.

Μια πρακτική προφύλαξη: τα αλκαλικά διαλύματα χρωστικών αλλοιώνονται και σχηματίζουν ίζημα κατά την αποθήκευση και την πρόσληψη διοξειδίου του άνθρακα. Τα εργαστήρια είτε παρασκευάζουν μικρές ποσότητες είτε αγοράζουν το έτοιμο διάλυμα του καταλόγου και τηρούν τον χρόνο διατήρησής του, αντί να συντηρούν μια παλιά φιάλη που πλέον αφήνει ίζημα σε κάθε αντικειμενοφόρο πλάκα.

Πολυχρωμικό κυανό του μεθυλενίου: μία ονομασία, πολλές χρωστικές

Το πολυχρωμικό κυανό του μεθυλενίου ξεκινά από την ίδια χρωστική, αλλά την υποβάλλει σε ελεγχόμενη οξείδωση σε αλκαλικό περιβάλλον, μια διαδικασία που ιστορικά ονομαζόταν ωρίμανση ή πολυχρωματισμός. Η γήρανση σε αλκαλικό περιβάλλον, η θέρμανση με ανθρακικό άλας ή η οξείδωση με παράγοντες όπως το διχρωμικό απομακρύνουν σταδιακά μεθυλομάδες από τους διμεθυλαμινοϋποκαταστάτες. Το προϊόν είναι ένα μείγμα: υπολειμματικό κυανό του μεθυλενίου μαζί με azure B (απώλεια μίας μεθυλομάδας), azure A και azure C (περαιτέρω απομεθυλίωση), θειονίνη (πλήρης απομεθυλίωση) και οξειδωτικά παραπροϊόντα της οικογένειας του ιώδους του μεθυλενίου. Κάθε συστατικό έχει τη δική του απόχρωση και συγγένεια προς τους ιστούς, οπότε το μείγμα προκαλεί μεταχρωματική χρώση: οι πυρήνες, τα κοκκία, οι βλεννίνες και ο χόνδρος αποκτούν διακριτούς τόνους από μπλε έως ερυθροϊώδεις.

Η χημεία αυτή είναι η ίδια που βρίσκεται πίσω από τις γνωστές χρώσεις αίματος. Οι πρώτοι ερευνητές διαπίστωσαν ότι το αλκαλοποιημένο κυανό του μεθυλενίου χρωμάτιζε τους πυρήνες των παρασίτων της ελονοσίας σε αποχρώσεις του μωβ, αλλά τα υδατικά διαλύματα που είχαν υποστεί ωρίμανση ήταν ασταθή και σχημάτιζαν ίζημα μέσα σε λίγες ημέρες. Η ανασκόπηση για το πώς επινοήθηκε η μωβ χρώση αίματος περιγράφει πώς οι Malachowski και Romanowsky αξιοποίησαν ανεξάρτητα αυτό το φαινόμενο το 1891, πώς εισήχθη η μεθανόλη για τη σταθεροποίηση του ιζήματος της χρωστικής και τη μονιμοποίηση επιχρισμάτων χωρίς θερμότητα, και πώς ο Giemsa αργότερα τυποποίησε το μείγμα χρησιμοποιώντας μετρημένες ποσότητες azure B και ηωσίνης, με σταθεροποίηση μέσω γλυκερόλης. Οι σύγχρονες χρώσεις τύπου Giemsa προέρχονται άμεσα από το πολυχρωμικό κυανό του μεθυλενίου σε συνδυασμό με ηωσίνη, τον συνδυασμό που παράγει το φαινόμενο Romanowsky. Για αναλυτικές πληροφορίες σχετικά με τον συνδυασμό με ηωσίνη και το συστατικό azure B, δείτε τις χρώσεις τύπου Romanowsky και την αλληλεπίδραση azure B με ηωσίνη.

Επειδή είναι μείγμα, το πολυχρωμικό κυανό του μεθυλενίου είναι εκ φύσεως το λιγότερο τυποποιημένο από τα τρία. Η ακριβής ισορροπία των αποχρώσεών του εξαρτάται από τη μέθοδο και τον βαθμό οξείδωσης. Γι’ αυτό οι προμηθευτές ιστολογικών υλικών το πωλούν ως ξεχωριστό προϊόν με δικούς του ελέγχους απόδοσης και όχι ως παλαιωμένο διάλυμα Loeffler. Οι συνήθεις χρήσεις περιλαμβάνουν τη μεταχρωματική ανάδειξη κοκκίων μαστοκυττάρων, βλεννινών και χόνδρου, την ανάδειξη λεπτομερειών των πλασματοκυττάρων και του Helicobacter pylori σε ιστολογικές τομές με πολυχρωμικές μεθόδους τύπου Goodpasture. Είναι η σωστή επιλογή όταν το ζητούμενο είναι η διαφοροποίηση μέσω χρώματος και η λάθος επιλογή όταν το πρωτόκολλο απαιτεί ένα καθαρό, μονοχρωματικό περίγραμμα των βακτηρίων.

Σύγκριση σύνθεσης και σκοπού

Διαβάστε τον πίνακα ως διαδικασία λήψης απόφασης. Αν το παρασκεύασμα χρωματίζεται πολύ αχνά, αλλάξτε την προσέγγιση ως προς το pH και επιλέξτε το διάλυμα Loeffler. Αν όλα χρωματίζονται αλλά τίποτα δεν διαφοροποιείται, αλλάξτε την προσέγγιση ως προς τη χρωστική και επιλέξτε το πολυχρωμικό διάλυμα. Αν ένα επίχρισμα χρωματισμένο κατά Loeffler αναδεικνύει εξαιρετικά τα κοκκία, αλλά ο υπεύθυνος ρωτά γιατί οι πυρήνες και το κυτταρόπλασμα έχουν το ίδιο μπλε χρώμα, η απάντηση είναι ότι καμία αλκαλική μονοχρωματική χρώση δεν μπορεί να επιτελέσει αυτή τη διαφοροποίηση. Αυτό το ζητούμενο αφορά την πολυχρωμική οικογένεια και τα παράγωγά της για χρώσεις αίματος.

Αποφυγή των συνηθισμένων συγχύσεων

Δύο λάθη ευθύνονται για το μεγαλύτερο μέρος της σύγχυσης. Το πρώτο είναι να θεωρείται το διάλυμα Loeffler εναλλάξιμο με το απλό κυανό του μεθυλενίου, επειδή και τα δύο φαίνονται μπλε στη φιάλη. Διαφέρουν ως προς το pH και την ένταση, και η αντικατάσταση του διαλύματος Loeffler με ουδέτερη χρωστική, όταν το πρώτο ορίζεται στο πρωτόκολλο, οδηγεί στην απώλεια ακριβώς της αντίθεσης των κοκκίων στην οποία βασίζεται το πρωτόκολλο. Το δεύτερο είναι να θεωρείται πολυχρωμικό οποιοδήποτε παλιό ή τυχαία παλαιωμένο αλκαλικό κυανό διάλυμα. Η ανεξέλεγκτη γήρανση παράγει ένα άγνωστο μείγμα άγνωστης ισχύος, ενώ τα πραγματικά πολυχρωμικά διαλύματα παρασκευάζονται με καθορισμένες μεθόδους οξείδωσης και, στην εξέλιξη των χρώσεων αίματος, συνδυάζονται με μετρημένη ποσότητα ηωσίνης. Η ιστορία είναι διδακτική εδώ: τα ασταθή υδατικά διαλύματα ωρίμανσης της δεκαετίας του 1890 έδωσαν τη θέση τους σε σταθεροποιημένες μεθανολικές συνθέσεις, ακριβώς επειδή τα ανεξέλεγκτα μείγματα δεν μπορούσαν να αναπαραχθούν. Αξίζει να θυμάστε αυτό το μάθημα πριν χρωματίσετε μια διαγνωστική αντικειμενοφόρο πλάκα με διάλυμα από φιάλη αβέβαιης ηλικίας.

Η ακρίβεια στις ονομασίες ολοκληρώνει την εικόνα. Επιβεβαιώστε στην ετικέτα το είδος του καταλόγου (υδατικό, κατά Loeffler ή πολυχρωμικό), την περιεκτικότητα σε χρωστική και την προβλεπόμενη εφαρμογή, αντί να τα συμπεραίνετε από το χρώμα. Οι τρεις συνθέσεις έχουν κοινή προέλευση ως προς το χρωμοφόρο. Δεν έχουν κοινό σκοπό.