Methylenblau und Bartonella: Laborbefunde und Grenzen der klinischen Evidenz

Eine Kulturschale und ein Patient haben ein Wort gemeinsam: Infektion. Doch das Wort bezeichnet jeweils etwas anderes. In der Schale ist eine Infektion eine Anzahl von Kolonien auf Agar. Beim Patienten umfasst sie Bakterien in Zellen und Gefäßen, Wirkstoffe, die sich durch Blut und Gewebe bewegen, und ein Immunsystem, das einen Teil der Arbeit übernimmt. Wer beides verwechselt, lässt eine auffällige Laborzahl wie eine Behandlung erscheinen. Wer beides auseinanderhält, erkennt in derselben Zahl das, was sie ist: einen Anlass für das nächste Experiment.

Genau diese Unterscheidung ist die Aufgabe dieses Überblicks zu Methylenblau und Bartonella. Zwei Laborstudien derselben Forschungsgruppe prüften Methylenblau gegen Bartonella henselae in nicht wachsenden Zuständen. Beide berichteten über eine starke Aktivität in Glas- und Kunststoffgefäßen. Keine der beiden untersuchte einen Menschen.

Warum Forschende die stationäre Phase untersuchen

Die meisten Antibiotikatests verwenden wachsende Zellen. Dieses Modell erfasst einen schwierigeren Fall nicht: Zellen, die sich nicht mehr teilen und Wirkstoffe tolerieren, die ihre wachsenden Artgenossen abtöten.

Bartonella kann im Körper persistieren, unter anderem in Erythrozyten und Endothelzellen. Die Forschungsgruppe untersuchte daher, welche zugelassenen Arzneimittel B. henselae abtöten können, nachdem die Bakterien in die stationäre Phase eingetreten sind. Eine niedrige MIC gegen wachsende Zellen sagte die Abtötung in der stationären Phase nicht voraus. Rifampicin hatte eine sehr niedrige MIC, tötete stationäre Zellen jedoch nur schlecht ab, während Substanzen mit höheren MIC-Werten sie gut abtöteten. Wer eine allgemeine Methode zur Bewertung solcher Veröffentlichungen sucht, findet sie im Leitfaden zum Lesen von Methylenblau-Forschung.

Erstes Screening: Li und Kollegen, 2019

Das Screening zur stationären Phase von 2019 in Antibiotics verwendete einen einzigen Stamm, B. henselae JK53, der in Schneider-Medium mit 10 Prozent fetalem Rinderserum bei 37 C und 5 Prozent CO2 gezüchtet wurde. Einen Tag alte Kulturen bestanden überwiegend aus einzeln verteilten, sich teilenden Zellen. Fünf Tage alte Kulturen mit etwa 10 hoch 8 koloniebildenden Einheiten pro mL wurden als stationäre Phase eingestuft und enthielten sichtbare Aggregate.

Für den Test wurden SYBR Green I und Propidiumiodid verwendet, kalibriert anhand von Mischungen aus lebenden und mit Isopropanol abgetöteten Zellen. Da Methylenblau stark gefärbt ist, wurden Treffer zunächst mikroskopisch und anschließend durch Koloniezählungen auf Blutagar bestätigt, dem strengeren Endpunkt.

Beim Screening von 1,581 zugelassenen Arzneimitteln bei 50 Mikromolar betrug die verbleibende Viabilität unter Methylenblau laut Plattenlesegerät 16 Prozent und laut Mikroskopie 25 Prozent. Daptomycin erreichte 21 Prozent, mehrere Azole 22 bis 27 Prozent, Gentamicin 32 Prozent, Erythromycin 66 Prozent und Ciprofloxacin 74 Prozent. Pyrviniumpamoat erschien im Plattenlesegerät stärker wirksam, ließ sich wegen seiner Eigenfluoreszenz jedoch mikroskopisch nicht bewerten.

Gegen wachsende B. henselae betrug die MIC von Methylenblau 0.08 bis 0.16 Mikrogramm pro mL. Bei fünf Tage alten stationären Zellen waren unter 5 Mikrogramm pro mL nach einem Tag Exposition keine Kolonien mehr nachweisbar. Dies entsprach den Ergebnissen von Daptomycin und Pyrviniumpamoat bei den jeweils getesteten Konzentrationen. Ein separater Abtötungsversuch im Zeitverlauf verwendete 10 Mikrogramm pro mL. Das sind Expositionskonzentrationen im Labor, keine Dosierungen, und die Veröffentlichung bezeichnet sie auch so. Ein zitierter Spitzenwert im menschlichen Plasma von etwa 3.9 Mikrogramm pro mL erscheint in der Veröffentlichung lediglich als Hintergrundinformation. Der Überblick zur Pharmakokinetik von Methylenblau erläutert, warum ein Plasmawert nicht als Gewebewert verstanden werden kann.

Die Veröffentlichung benennt zwei Einschränkungen ausdrücklich. Es gab weder ein Biofilmmodell noch Kombinationstests mit Methylenblau. Die Aggregate nach fünf Tagen waren Zellansammlungen in einer stationären Flüssigkultur, kein validiertes Biofilmexperiment. Die Autoren forderten Tierversuche, Untersuchungen zu Kombinationen und Biofilmen sowie Tests mit anderen Bartonella-Arten.

Kombinationen und aus Biofilmen gewonnene Zellen: Zheng und Kollegen, 2020

Die Folgestudie von 2020 in BMC Microbiology behielt denselben Stamm und dasselbe Medium bei, verwendete jedoch sechs Tage alte stationäre Kulturen und ergänzte zwei Aspekte, die in der ersten Veröffentlichung fehlten: Kombinationen aus zwei Wirkstoffen und ein Modell mit aus Biofilmen gewonnenen Zellen.

Bei Einzelwirkstoffen mit einer einheitlichen Konzentration von 5 Mikrogramm pro mL über 24 Stunden verblieben unter Methylenblau 3.2 mal 10 hoch 4 koloniebildende Einheiten pro mL, gegenüber etwa 2.8 mal 10 hoch 10 in der Kontrolle. Unter Ciprofloxacin, Gentamicin und Nitrofurantoin verblieben zum selben Zeitpunkt weniger Kolonien. Das unterscheidet sich vom Ergebnis von 2019, bei dem nach einem Tag bei derselben nominellen Konzentration keine Kolonien nachweisbar waren. Alter, Dichte und Handhabung der Kulturen unterschieden sich. Die Abtötung war daher in ihrer Richtung reproduzierbar, in ihrem Ausmaß jedoch nicht identisch. Diese Unterschiede zwischen Versuchsdurchläufen sind ein Grund dafür, dass übliche Sicherheits- und Wechselwirkungsprüfungen die Wirksamkeit im Labor getrennt von der klinischen Wirkung betrachten.

Das Kombinationsscreening ist der am häufigsten zitierte Teil. Jede Komponente wurde auf 5 Mikrogramm pro mL festgelegt. Sowohl unter Azithromycin plus Methylenblau als auch unter Rifampicin plus Methylenblau waren nach 24 Stunden keine Kolonien aus der stationären Phase nachweisbar. Dasselbe galt für beide Ciprofloxacin-Kombinationen. Unter den 25 getesteten Kombinationen erreichten nur diese vier dieses Ergebnis. Es wurde keine formale Synergieanalyse durchgeführt. Die korrekte Bezeichnung lautet daher unter diesen Bedingungen aktive Kombination, nicht nachgewiesene Synergie.

Das Biofilmexperiment untersuchte Zellen, die aus einem jungen, aufgebrochenen Biofilm gewonnen wurden, nicht das Eindringen in einen intakten, ausgereiften Biofilm. Kulturen wurden fünf Tage lang gezüchtet, verdünnt und für weitere fünf Tage in Mikrotiterplatten kultiviert. Die Biofilmbildung wurde durch Kristallviolettfärbung bestätigt. Anschließend wurden die Biofilme vor der Wirkstoffexposition abgekratzt. Bei 5 Mikrogramm pro mL sank die Zahl unter Methylenblau allein bis Tag 6 auf 2.3 mal 10 hoch 2, eines der besten Ergebnisse unter den Einzelwirkstoffen, jedoch nicht null. Beide Methylenblau-Kombinationen erreichten bis Tag 6 null, ebenso beide Ciprofloxacin-Kombinationen.

Die Autoren benannten dieselben Einschränkungen, die auch aufmerksamen Lesern auffallen würden: ein junger, abgekratzter Biofilm statt eines alten, intakten Biofilms; eine einheitliche, praktisch gewählte Konzentration für alle Wirkstoffe statt einer jeweils realistischen Spitzenkonzentration; nur ausgewählte Kombinationen mit Azithromycin oder Rifampicin; ein einziger Stamm; keine Tiere; keine Patienten. Spätere Untersuchungen mit drei Wirkstoffen wurden vorgeschlagen, aber nicht berichtet.

Vergleich der Studiendesigns

Die Tabelle fasst die Kernaussage dieses Artikels zusammen. Alles links von der letzten Spalte sind Untersuchungen an Kulturen. Keine der beiden Veröffentlichungen liefert Ergebnisse für die letzte Spalte.

Bartonella ist nicht Borrelia

Beide Veröffentlichungen erwähnen Borrelia burgdorferi, die Spirochäte, die Lyme-Borreliose verursacht. Der Grund ist, dass der Farbstofftest aus früheren Untersuchungen zur stationären Phase von Borrelia im selben Labor stammte, bei denen Methylenblau und Daptomycin ebenfalls als Treffer aufgefallen waren. Diese Vorgeschichte bietet hilfreichen Kontext und ist zugleich eine häufige Fehlerquelle.

Kein Experiment in einer der beiden Bartonella-Veröffentlichungen testet Borrelia unmittelbar neben Bartonella. Die Organismen, Medien und Konzentrationen unterscheiden sich. Der vermutete Membraneffekt von Methylenblau bei Bartonella wurde ausdrücklich als Spekulation bezeichnet, die weitere Untersuchungen erfordert. Ergebnisse sollten nicht von einer Art auf eine andere übertragen werden, und keine der beiden Veröffentlichungen stützt allgemeine Aussagen über Parasiten. Der Vergleich von Borrelia- und Bartonella-Persisterzellen hält die beiden Forschungsgebiete aus diesem Grund auseinander.

Warum aus Kulturen kein Behandlungsprotokoll wird

Das Suchinteresse an einem Behandlungsprotokoll mit Methylenblau bei Bartonella ist nachvollziehbar. Diese Veröffentlichungen zeigen, warum dieser Ausdruck als Warnsignal und nicht als Einkaufsliste verstanden werden sollte.

Erstens sind 5 Mikrogramm pro mL in einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte keine Verordnung. Dieser Wert enthält keine Angaben zu Resorption, Verteilung, Proteinbindung, intrazellulärem Eindringen oder Verträglichkeit. Die Autoren wählten ihn als groben Durchschnitt antibiotischer Spitzenkonzentrationen und erklärten, dass künftige Untersuchungen für jeden Wirkstoff eine eigene realistische Konzentration verwenden sollten.

Zweitens bedeutet null Kolonien, dass unter den jeweiligen Ausplattierungsbedingungen keine Kolonien nachweisbar waren, nicht dass Gewebe steril ist. Persisterzellen, intrazelluläre Bakterien und Grenzen der Probenahme liegen allesamt außerhalb dessen, was die Agarplatte erfasst.

Drittens können Kombinationen, die eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte sterilisieren, im Körper versagen oder schaden. Azithromycin plus Methylenblau und Rifampicin plus Methylenblau sind Laborkombinationen bei Laborexpositionen. Ohne pharmakokinetische Daten aus Tierversuchen und kontrollierte Daten am Menschen gibt es keine festgelegte Dosis, keine festgelegte Dauer und kein bestimmbares Nutzen-Risiko-Verhältnis. Wer Optionen abwägt, sollte diese mit einem Arzt besprechen und sich darüber informieren, wann die Anwendung von Methylenblau ärztliche Überwachung erfordert, bevor aus Daten aus Kulturschalen Schlussfolgerungen gezogen werden.

Die eng begrenzte Schlussfolgerung, die diese Veröffentlichungen tatsächlich stützen, lautet: Methylenblau zeigt in vitro eine reproduzierbare Aktivität gegen nicht wachsende B. henselae JK53, auch in Laborkombinationen aus zwei Wirkstoffen. Die stärksten Ergebnisse zu Kombinationen und aus Biofilmen gewonnenen Zellen stammen aus der Studie von 2020. Alles Weitere, einschließlich der Frage, ob diese Aktivität für die Bartonellose beim Menschen relevant ist, bleibt ungeprüft.