Simpel farvning med methylenblåt versus gramfarvning: hvad hver metode kan påvise

En studerende laver et udstrygningspræparat fra en kultur mærket E. coli, dækker det med methylenblåt i ét minut, skyller og ser gennem olieimmersionsobjektivet. Blå stave dækker synsfeltet. I laboratorierapporten står der: "Gramnegative stave identificeret som E. coli." Observationen er korrekt. Konklusionen er der ikke belæg for i dette præparat.

Fejlen er begrebsmæssig, ikke teknisk. Den studerende behandlede en simpel farvning, som om den var en differentiel test. En simpel farvning og en gramfarvning besvarer forskellige spørgsmål, fordi de bygger på forskellige farvningsprincipper. Den ene spørger: hvilken form er til stede? Den anden spørger: hvordan reagerer cellevæggen, når den udsættes for en påvirkning? Bland de to sammen, og et korrekt farvet præparat fører til en rapport uden tilstrækkeligt belæg.

Denne sammenligning holder de to metoder adskilt, viser, hvilke konklusioner hvert resultat giver grundlag for, og besvarer de to spørgsmål, som studerende oftest stiller: Kan methylenblåt bruges ved gramfarvning, og hvad viser en farvning af E. coli med methylenblåt egentlig?

Det korte svar

Simpel farvning med methylenblåt farver alle farvbare celler i den samme blå farve, så den viser morfologi (stave, kugler, spiraler) og lejring (enkeltvis, par, kæder), men intet om gramkategori. Gramfarvning tilføjer jod, et affarvningstrin og en kontrastfarvning, så den adskiller bakterier i grampositive (violette) og gramnegative (lyserøde eller røde) ud fra, hvordan deres cellehylstre tilbageholder farvestoffet. Blå stave efter methylenblåt betyder "stavformede celler er til stede". Lyserøde stave efter en fuld gramfarvningssekvens betyder "gramnegative stave er til stede". Det andet udsagn er stærkere, fordi proceduren omfattede en yderligere test.

Se atlasset over farvning til mikroskopi for den bredere gruppe af bakterielle metoder med ét farvestof, som denne artikel hører til.

Simpel farvning: ét farvestof, ét spørgsmål

Methylenblåt er et basisk (kationisk) farvestof. Dets farvede ion har en positiv ladning og binder til negativt ladede strukturer i cellen, herunder nukleinsyrer og sure overfladegrupper, så cellerne fremstår blå mod en lys baggrund. OpenStax beskriver dette princip for positiv farvning i sit kapitel om farvning. Selve farvestofkationen er den lille, flade phenothiazinion, som beskrives nærmere i den kemiske reference om methylenblåt; chloridmodionen står ikke for farvningen.

En standardprotokol til undervisning er bevidst enkel: Lav et tyndt udstrygningspræparat, lad det lufttørre, varmefiksér det, dæk det med en vandig opløsning af methylenblåt på cirka 1% i omtrent ét minut, skyl forsigtigt med vand, dup det tørt, og undersøg det med olieimmersion. En undervisningsprotokol fra LibreTexts angiver netop denne fremgangsmåde med 1% i ét minut, samtidig med at den bemærker, at nogle laboratorier forlænger tiden. Intet bejdsemiddel, intet affarvningsmiddel, intet andet farvestof. Det er netop pointen. Med kun ét farvestof og uden selektiv fjernelse ender alle celler, der binder farvestoffet, med samme farve.

Med E. coli forventes synsfeltet at vise blå stave (baciller), enkeltvis, parvis eller i små grupper. Den blå farve kommer fra farvestoffet. Stavformen kommer fra organismen. Men kombinationen identificerer ikke organismen, fordi mange arter er stavformede, og mange stave farves blå ved simpel farvning. ATCC gør denne begrænsning til morfologi tydelig i sin vejledning om mikrobiologiske kulturer. En korrekt rapport lyder: "blå baciller observeret". Alt ud over form og lejring kræver mere dokumentation.

Gramfarvning: fire reagenser, én test af adfærd

Gramfarvning er en differentiel farvning. Den udsætter alle celler for den samme sekvens og viser, hvilke celler der beholder det første farvestof, og hvilke der mister det. Gramfarvningsprotokollerne fra American Society for Microbiology angiver den standardiserede rækkefølge i fire trin: krystalviolet (primært farvestof), Grams jodopløsning (bejdsemiddel), alkohol eller acetone-alkohol (affarvningsmiddel) og derefter safranin (kontrastfarvestof).

Den almindelige undervisningsmodel forklarer forskellen ud fra cellehylstrets struktur. Grampositive celler har en tyk peptidoglycanvæg, der dehydreres og tilbageholder krystalviolet-jod-komplekset under alkoholskylningen. Gramnegative celler har et tyndt peptidoglycanlag samt en lipidrig ydre membran, som affarvningsmidlet nedbryder, så komplekset skylles ud, og cellerne derefter optager safranin. Oversigten over gramfarvning i NCBI Bookshelf giver denne forklaring ud fra cellevæggen. Specialister tilføjer, at den samlede fysisk-kemiske proces er mere kompliceret end væggens tykkelse alene, men ved fortolkning i laboratoriet gælder reglen for adfærden: Violet betyder tilbageholdt, lyserød betyder fjernet og derefter kontrastfarvet.

Illustrative paneler. Stiliserede tegninger til sammenligning af metoder, ikke mikrofotografier taget med kamera. Farverne er forenklet for at formidle logikken: én farve ved simpel farvning, to farver efter affarvning i gramfarvningen.

Kan methylenblåt bruges ved gramfarvning

Dette spørgsmål kan forstås på to måder, og de kræver forskellige svar.

Den første fortolkning: Kan en enkelt påføring af methylenblåt erstatte hele gramfarvningssekvensen? Nej. Uden jod, affarvningsmiddel og kontrastfarvestof er der intet differentielt trin, så ingen gramkategori testes. Et blåt synsfelt efter methylenblåt alene er resultatet af en simpel farvning, selv hvis flasken står ved siden af reagenserne til gramfarvning. Registrér det ikke som et gramfarvningsresultat.

Den anden fortolkning: Kan methylenblåt erstatte safranin som kontrastfarvestof i trin 4? Funktionelt kan det farve de affarvede celler, og en lærebogsøvelse forudsiger violette grampositive celler og blå gramnegative celler efter en sådan udskiftning. Logikken holder, fordi korrekt affarvede gramnegative celler er næsten farveløse og vil optage et andet kationisk farvestof. Men det er ikke standardprotokollen. ASM-protokollerne foreskriver safranin, med anerkendte alternativer som basisk fuchsin i nogle varianter, ikke methylenblåt. Der er også en praktisk ulempe: Blå og violet er sværere at skelne end lyserød og violet, især for begyndere og især under svage mikroskoplamper. Ved undervisning og ved ethvert resultat, der har betydning, skal du bruge det kontrastfarvestof, din protokol angiver, som regel safranin, og betragte kontrastfarvning med methylenblåt som en demonstrationsvariant frem for en tilsvarende standardmetode.

Det beslægtede spørgsmål om, hvordan methylenblåt klarer sig sammenlignet med andre muligheder med ét farvestof, behandles i en sammenligning af simple bakteriefarvninger.

Hvad farvning af E. coli med methylenblåt påviser, og hvad den ikke påviser

E. coli er en gramnegativ stav, men den sætning kombinerer fakta fra flere metoder: morfologi fra mikroskopi, gramreaktion fra en gramfarvning og identitet fra dyrkning samt biokemiske eller molekylære tests. Et udstrygningspræparat farvet med methylenblåt bidrager kun med den første del. Det fastslår, at stavformede celler er til stede i den farvede prøve, og hvordan de er lejret. Det fastslår ikke gramreaktionen, fordi cellerne ikke blev udsat for et affarvningstrin. Det identificerer ikke arten, fordi stave fra mange arter ligner hinanden ved denne opløsning.

Her går rapporter galt på en forudsigelig måde. Forfatteren fører baggrundsviden ("denne kultur skulle være E. coli, og E. coli er gramnegativ") ind i observationsbeskrivelsen, så præparatet ser ud til at bekræfte det, der i virkeligheden blev antaget. En mere præcis rapport adskiller niveauerne: "Simpel farvning med methylenblåt: blå baciller observeret; kun morfologi, ingen gramkategori testet." Derefter, hvis en gramfarvning blev udført korrekt med kontroller: "Gramfarvning: lyserøde stave, foreneligt med gramnegative bakterier." Artsidentiteten kommer senere fra identifikationsforløbet, ikke fra farven alene.

En praktisk vejledning til fortolkning

Brug denne beslutningsregel ved laboratoriebordet. Hvis alle celler har én farve, og protokollen brugte ét farvestof uden affarvningsmiddel, har du udført en simpel farvning. Rapportér form, anslået størrelse og lejring. Stop dér. Hvis protokollen omfattede krystalviolet, jod, affarvningsmiddel og kontrastfarvestof med kendte positive og negative kontroller, har du udført en gramfarvning. Rapportér farve og morfologi: violette kokker i kæder, lyserøde stave og så videre.

Tre fejl står for det meste af forvirringen. For det første at overfortolke blå stave som en bekræftelse af E. coli. For det andet at registrere et præparat med methylenblåt under overskriften "Gramfarvning" i en notesbog, hvilket senere læsere vil fejlfortolke. For det tredje at skifte kontrastfarvestoffer uden videre og derefter sammenligne farver på tværs af laboratorier, som om farvepaletterne var ens. Hver fejl har den samme løsning: Angiv den metode, der faktisk blev udført, og konkludér kun det, som metoden tester.

Simpel farvning har sin berettigelse, netop fordi den giver grundlag for få konklusioner. Den er hurtig, robust og tilstrækkelig, når spørgsmålet handler om morfologi: Er der noget, og hvilken form har det? Når spørgsmålet handler om klassifikation, skal du udføre den differentielle test. Det blå præparat fortæller dig, hvordan cellerne ser ud. Det violette eller lyserøde præparat fortæller dig, hvordan deres vægge reagerer. Intet af præparaterne fortæller dig arten alene.