Ny methylenblåt og retikulocytfarvning: et særskilt farvestof og en metode til levende celler

En studerende forbereder en retikulocyttælling, bestiller methylenblåt, blander det med blod og ser næsten ingenting. En medstuderende bruger en flaske mærket ny methylenblåt og får tydelige blå filamenter inde i en del af de røde blodlegemer. Den første studerende antager, at den anden flaske er friskere eller mere koncentreret. Ingen af delene er tilfældet. Den indeholder et andet molekyle.

Denne begrebsfejl ligger bag det meste af forvirringen på området. Navnet antyder, at ny methylenblåt er et forbedret parti methylenblåt. Kemien siger noget andet. Ny methylenblåt N er et særskilt phenothiazinfarvestof med sit eget Colour Index-nummer, sit eget substitutionsmønster og sin egen standardiserede rolle i hæmatologien. Når denne forskel er klar, bliver resten af metoden ligetil: hvorfor cellerne skal være levende under farvningen, hvad der tæller som en retikulocyt, hvor Heinz-legemer passer ind, og hvornår brillant cresylblåt kommer ind i billedet.

Det korte svar

Ny methylenblåt N, det hæmatologiske reagens, identificeres generelt som Basic Blue 24 i PubChem-posten for ny methylenblåt, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, formel C18H22ClN3S. Almindeligt methylenblåt er methylthioniniumchlorid, Basic Blue 9, i den tilhørende PubChem-post, C.I. 52015, CAS 61-73-4, formel C16H18ClN3S. Strukturelt har ny methylenblåt to methylgrupper på ringsystemet og ethylaminosidekæder, hvor methylenblåt har dimethylaminogrupper. Denne forskel ændrer farvningsegenskaberne. Hæmatologiske lærebøger beskriver almindeligt methylenblåt som et relativt dårligt farvestof til retikulocytter og ny methylenblåt som mere intenst og ensartet, en sammenligning opsummeret i ScienceDirects emneside om ny methylenblåt.

Ja, ny methylenblåt er et supravitalt farvestof. Supravital farvning betyder farvning af levende celler efter udtagning fra kroppen og før fiksering, som defineret i NCBI's gennemgang af principperne for supravital farvning. Både ny methylenblåt og brillant cresylblåt tilhører denne kategori, og CLSI's retikulocytstandard omfatter udtrykkeligt ny methylenblåt som et supravitalt farvestof. Studerende placerer det undertiden i samme kategori som Romanowsky-farvning af fikserede udstrygninger. Den forståelse holder ikke her. Fikseres cellerne først, virker metoden ikke længere.

For læsere, der holder styr på beslægtede farvestofnavne, handler methylblåt versus methylenblåt om en anden og større forveksling mellem et anionisk triarylmethanfarvestof og den kationiske phenothiazinfamilie. Oversigten over laboratoriefarvning sætter supravitalt arbejde i sammenhæng med metoder til fikserede udstrygninger, og vejledningen om blodcellers morfologi viser, hvor retikulocytvurdering passer ind i den bredere differentialtælling.

En advarsel ved katalogopslag: Der findes en særskilt zinkchlorid-dobbeltsaltform af ny methylenblåt under CAS 6586-05-6. Et metodeafsnit bør derfor angive saltformen og leverandøren, ikke kun det almindelige navn.

Hvad supravital farvning faktisk gør

En retikulocyt er et ungt rødt blodlegeme, der har mistet sin kerne, men stadig indeholder rester af ribosomalt RNA. I et ufarvet vådpræparat er dette RNA usynligt. Det supravitale farvestof trænger ind i den levende celle og udfælder eller aggregerer dette RNA til blå granula og filamenter, det retikulofilamentøse materiale, der ses ved olieimmersion. Netværket er altså et produkt af farvningen, ikke et allerede dannet skelet, der venter på farve. Derfor har protokolvariablerne (farvestofkoncentration, buffer, forholdet mellem blod og farvestof, temperatur, tid) lige så stor betydning som farvestoffets navn.

Den praktiske konsekvens er en fast rækkefølge: Bland først antikoaguleret blod med farvestof, inkubér, og lav derefter udstrygninger, som undersøges ufikserede og uden kontrastfarvning. Fiksering før farvning eller en kontrastfarvning, der skjuler svage filamenter, ødelægger den information, tællingen afhænger af.

En praktisk retikulocytprotokol med ny methylenblåt

Der findes ikke én universel formulering, så angiv den, der anvendes. Tre dokumenterede varianter viser spændvidden.

Den klassiske procedure af Brecher-typen bruger cirka 0.5 procent ny methylenblåt med kaliumoxalat, blandet i lige store volumener med godt blandet EDTA-blod og inkuberet i cirka 10 til 15 minutter ved stuetemperatur. Efter forsigtig genblanding fremstilles tynde kileudstrygninger, som lufttørres og undersøges ufikserede med 100x-olieimmersionsobjektivet. NCBI's procedure for retikulocyttælling beskriver denne arbejdsgang og den tælleramme, der bruges sammen med den.

Dacie og Lewis-varianten bruger 1.0 procent ny methylenblåt i citrat-saltvand, blandet med 2 til 4 volumener blod og holdt ved 37 C i 15 til 20 minutter før udstrygning. En nyere harmoniseret implementering af CLSI H44-proceduren brugte en mindre koncentreret opløsning på 0.1 procent i fosfatbufferet saltvand ved pH 7.4, med inkubation ved 20 C i 10 minutter og uden fiksering, som rapporteret i NMB-harmoniseringsstudiet fra 2026.

Tællereglerne er fælles for varianterne. Registrér en celle som en retikulocyt, når den indeholder mindst to adskilte blåfarvede granula eller filamentsegmenter, så isolerede farvestofaflejringer ikke medregnes. Tæl mindst 1,000 røde blodlegemer ved rutineundersøgelser, og angiv retikulocytter i procent. Ved lave procentandele kræver statistikken flere celler. En gennemgang af CLSI H44-metoden bemærker, at der ved omkring 1 procent retikulocytter kræves cirka 4,400 celler for at bringe tællevariationen ned på 5 procent, i CLSI H44-gennemgangen hos De Gruyter. En Miller-okularskive gør store tællinger praktisk mulige. Filtrér farvestoffet, eller tilbered det frisk, da bundfald kan ligne granulære inklusioner.

Heinz-legemer i samme præparat

Den samme supravitale udstrygning kan også påvise Heinz-legemer, som er aggregater af oxideret og denatureret hæmoglobin snarere end rester af RNA. I præparater med ny methylenblåt fremstår de som runde legemer, ofte enkeltvis og tæt ved membranen, farvet lysere blå end det retikulofilamentøse materiale. De bevares dårligt gennem fiksering og kontrastfarvning, så undersøg den ufikserede udstrygning. En nyere protokol med 20 mikroliter EDTA-blod og 20 mikroliter 1 procent ny methylenblåt samt 15 minutters inkubation kvantificerede celler med Heinz-legemer blandt 250 erytrocytter, i PMC-studiet, der beskriver denne procedure.

To skel hjælper med at undgå fejltolkninger. For det første farver methylviolet og krystalviolet Heinz-legemer mere intenst end ny methylenblåt, som bemærket i ScienceDirects emneside om Heinz-legemer. Ny methylenblåt er det praktiske valg, når retikulocytter og Heinz-legemer vurderes sammen, men ikke det kraftigste farvestof specifikt til Heinz-legemer. For det andet giver HbH-inklusioner ved bærertilstand for alfa-thalassæmi talrige fine prikker fordelt over cellen efter supravital farvning, mens klassiske Heinz-legemer er færre, større og ofte knyttet til membranen. Farvestofaflejringer er en tredje kilde til forveksling: De ligger uden for cellernes fokusplan og varierer mellem synsfelter.

Brillant cresylblåt versus ny methylenblåt

Begge farvestoffer bruges til supravital farvning af retikulocytter, men standardiseringen favoriserer det ene. Retikulocytmetoden CLSI H44-A2, der er udviklet i samarbejde med International Council for Standardization in Haematology og opført på CLSI's side om H44-standarden, udpeger farvning af EDTA-blod med ny methylenblåt som den manuelle sammenligningsmetode. Klassisk hæmatologisk undervisning er enig om udseendet: Ny methylenblåt giver en mere intens og ensartet filamentfarvning, mens brillant cresylblåt varierer mere mellem partier og prøver.

Denne status kræver et forbehold. ICSH's retningslinje for evaluering af analyseinstrumenter accepterer manuel mikroskopi med ny methylenblåt som en tilgang til referencesammenligning, men betegner den som subjektiv og relativt upræcis og foretrækker flowcytometriske referenceprocedurer, hvor de er tilgængelige. En sammenligning af 100 prøver fra 2022 fandt mindre systematisk afvigelse i forhold til det anvendte analyseinstrument med brillant cresylblåt end med ny methylenblåt, som rapporteret i PMC-sammenligningen af farvningsmetoder. Den fagligt holdbare opsummering til studerende er: Brug ny methylenblåt som den standardiserede manuelle sammenligningsmetode, verificér enhver lokal metode med brillant cresylblåt mod denne eller mod en automatiseret metode, og forvent større spredning ved manuel mikroskopi i begge tilfælde. Ældre standardiseringslitteratur anbefalede også oprenset Azure B som et kemisk renere alternativ, fordi kommercielle farvestofpartier varierede, i Marshalls studie om Azure B. Det forklarer, hvorfor reagenskvalitet stadig indgår i metodediskussioner.

Undgå de typiske fejl

Fire fejl forklarer de fleste mislykkede præparater. Bestilling af almindeligt methylenblåt i stedet for ny methylenblåt N giver svag farvning på grund af kemien, ikke teknikken. Fiksering eller kontrastfarvning før aflæsning fjerner det supravitale signal. Medregning af farvestofbundfald som granula giver et for højt resultat, hvilket reglen om to granula og filtreret farvestof forebygger. Tælling af for få celler ved lave retikulocytprocenter giver et tal, der ser præcist ud, men har brede konfidensgrænser. Alle fejlene har samme kendetegn: Mikroskopøren giver mikroskopet skylden for det, der blev afgjort i reagenstrinnet.