Måling af methylenblåts mitokondrielle virkninger: ilt, ATP og membranpotentiale

Forestil dig, at et laboratorium tilsætter methylenblåt til mitokondrier med nedsat respiration og ser iltforbruget stige. Den nærliggende formulering er, at farvestoffet genoprettede mitokondriefunktionen. Den formulering kan være forkert. Iltflux, ATP-syntese og membranpotentiale er tre forskellige begreber. De deler den samme organel, ligesom sikkerhedskopiering, synkronisering og deling bruger den samme mappe i skyen: De hænger sammen, men følger forskellige regler. Forveksles det ene med det andet, holder fortolkningen ikke, selv når alle målinger er teknisk korrekte.

Methylenblåt gør denne forveksling sandsynlig, fordi det deltager i det system, det måler. Det er et stof, der indgår i redoxcykling ved at modtage elektroner opstrøms og afgive dem nedstrøms, en lipofil kation, der ophobes i energiserede mitokondrier, og en stærkt blå forbindelse, der absorberer og udsender lys i de samme bølgelængdebånd som almindelige prober. Ét enkelt måleresultat kan ikke rumme alt dette. Den pålidelige fremgangsmåde, som går igen i mitokondriestudierne fra Budapest, er at måle iltflux plus ATP-syntesehastighed plus membranpotentiale plus frigivelse af hydrogenperoxid med farvestofspecifikke kontroller ved hvert trin.

Respirometri måler iltflux, ikke energiudbytte

Højopløselig respirometri, hvad enten den udføres med Oroboros Oxygraph eller Seahorse-analyseudstyr til ekstracellulær flux, viser én ting: hvor hurtigt ilt reduceres. Den viser ikke, hvor mange protoner der blev pumpet pr. elektron, hvor stor en gradient der blev bevaret, eller om ATP-syntase udnyttede den.

Terminologien er vigtig. I isolerede mitokondrier giver substrat uden ADP lækagerespiration, substrat med en mættende ADP-koncentration giver kapaciteten for oxidativ fosforylering, og titrering med en afkobler giver den maksimale elektronoverførselskapacitet. I intakte celler er de tilsvarende Seahorse-mål basal respiration, oligomycinfølsom ATP-koblet respiration, protonlækage, FCCP-defineret maksimal respiration og rotenon- plus antimycinresistent ikke-mitokondrielt iltforbrug. At kalde Seahorse-resultater State 3 og State 4 tillægger dem en præcision, som præparatet ikke understøtter, hvilket Agilents ramme for Mito Stress Test tydeliggør.

Methylenblåt bryder den intuitive sammenhæng mellem mere ilt og mere energi. I isolerede mitokondrier fra marsvinehjerner øgede 100 nM til 1 uM farvestof iltforbruget i hvile med glutamat plus malat, succinat og alfa-glycerofosfat som substrater, med en stigning på omtrent 64 procent ved alfa-glycerofosfat. Alligevel var den ADP-stimulerede respiration i raske mitokondrier stort set uændret ifølge studiet af isolerede hjernemitokondrier. Fordi lækagen steg, mens den ADP-stimulerede flux forblev uændret, falder det beregnede respiratoriske kontrolforhold. Dette fald betyder ikke, at farvestoffet beskadigede mitokondrierne. Det betyder, at farvestoffet tilføjede en iltforbrugende redoxcyklus oven i den normale respiration. Et assay for iltforbrug med methylenblåt, der kun rapporterer stigningen, har målt reel kemi uden at sige noget om energibevarelse.

Genopretningsforsøgene viser den samme forskel i større skala. Med blokeret kompleks I blev iltfluxen øget omtrent tre gange, mens ATP-syntesen kun blev øget omtrent 1.5 gange. Mere ilt nåede elektroden. En mindre del af det bidrog til ATP-produktionen. Enhver påstand om forbedret oxidativ fosforylering kræver ATP-siden af regnskabet, helst udtrykt som et ATP pr. ilt-forhold med angivelse af den anvendte nævnerkonvention.

ATP-assays måler syntesehastighed, som ikke kan erstattes af ATP-indhold

Et ATP-assay besvarer et andet spørgsmål: hvor meget ATP der dannes pr. tidsenhed. En kinetisk måling, enten luminescens fra ildflueluciferase fulgt over minutter eller et koblet assay med hexokinase plus glucose-6-fosfatdehydrogenase målt ved 340 nm, giver en hastighed. En enkelt slutpunktsmåling af det samlede ATP giver et indhold, som afspejler syntese minus forbrug og i sig selv fortæller meget lidt om oxidativ fosforylering.

Gruppen fra Budapest anvendte den koblede enzymatiske metode med hæmmet adenylatkinase og fandt, at methylenblåt ved 1 til 2 uM øgede ATP-produktionen beskedent, men signifikant, i rotenonbehandlede og antimycinbehandlede mitokondrier. Det er en reel genopretning, og den er delvis. Studiet af TEGDMA-toksicitet nåede frem til samme type resultat i en anden model: 5 mM af den dentale monomer TEGDMA fik den kompleks I-koblede respiration til at falde fra omtrent 286 til 28 fluxenheder, og 2 uM farvestof genoprettede den til omtrent 86.

To kontroller er ufravigelige med en farvet redoxforbindelse. Brug for det første oligomycin til at fastslå, hvor stor en del af den målte ATP-syntese der afhænger af ATP-syntase. Udfør for det andet et cellefrit genfindingsforsøg med en kendt mængde tilsat ATP, den komplette reagensblanding og præcis de anvendte farvestofkoncentrationer, som minimum 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM og 2 uM. Farvestoffet kan absorbere udsendt lys, hæmme reporterenzymet eller ændre reagensernes redoxkemi, og den generelle vejledning til luciferaseassays anbefaler biokemiske kontrolassays netop for denne type interferens. Antag ikke, at 1 uM er fri for artefakter, blot fordi fluorescensslukning normalt er værre ved højere koncentrationer.

Membranpotentialeprober måler farvestoffets fordeling, ikke flux

Safranin O, TMRM og TMRE, rhodamin 123 og JC-1 er alle membranpermeable kationer. De ophobes i den negativt ladede matrix i henhold til elektrokemisk ligevægt, så den samlede fluorescens afspejler potentialet indirekte gennem probens placering. Ingen af dem måler ATP eller elektronflux.

Hver probe egner sig bedst til en bestemt type præparat. Safranin O er velegnet til isolerede mitokondrier og permeabiliserede celler, typisk ved omkring 2 uM med excitation nær 495 nm og emission nær 585 nm, i et regime med fluorescensslukning, hvor optagelsen ændrer den samlede fluorescens. TMRM og TMRE er velegnede til intakte celler ved lav nanomolær belastning uden fluorescensslukning, hvor depolarisering frigiver farvestof, og den mitokondrielle fluorescens falder; ved høj belastning kan signalets retning vendes gennem selvslukning. JC-1 giver et praktisk grønt/rødt-forhold, men afhænger af belastning og mitokondriemasse, hvilket gør det mindre egnet til kvantitativt arbejde end omhyggeligt kontrolleret TMRM. Disse afvejninger er opsummeret i en meget anvendt oversigtsartikel om prober for mitokondrielt membranpotentiale.

Methylenblåt interfererer optisk netop ved de anvendte koncentrationer. Dets absorptionsbånd nær 600 til 665 nm overlapper probernes røde emission, så indre filtereffekter, fluorescensslukning og absorption af excitationslys er alle plausible. Farvestoffet er desuden endnu en lipofil kation, hvis egen fordeling ændres med det potentiale, der måles. Modtrækket er redundans plus blindprøver: probe alene, farvestof alene, probe plus hver farvestofkoncentration, fuld depolarisering med FCCP som nulreference og helst en anden, optisk forskellig probe. Studiet af omgåelse af kompleks III etablerede denne fremgangsmåde ved at gentage genopretningen af membranpotentialet med både safranin O og TMRM efter hæmning med antimycin og myxothiazol og opnå den samme kvalitative genopretning. Én optisk reporter giver et fingerpeg. To uafhængige reportere giver evidens.

Tre præparater, tre forskellige spørgsmål

Isolerede mitokondrier, permeabiliserede celler og intakte celler er ikke indbyrdes udskiftelige følsomhedsindstillinger i ét assay. De er forskellige koncepter med forskellige funktionsprincipper.

Isolerede mitokondrier bevarer elektrontransportkæden, den indre membran og matrixens maskineri, mens plasmamembranen, cytosolen og netværksarkitekturen fjernes. Denne fjernelse er selve formålet: Substrater, ADP, inhibitorer og farvestofkoncentrationer er præcist definerede, så en reaktionsvej kan identificeres. Prisen er tab af den naturlige substrattilførsel, signalering og efterspørgsel.

Permeabiliserede celler bevarer mitokondrierne i en stor del af deres cellulære arkitektur, samtidig med at eksogene substrater og ADP kan passere gennem den åbnede plasmamembran. De er det rette værktøj til at lokalisere en defekt i en substratvej i en cellulær sammenhæng. Overpermeabilisering beskadiger den ydre membran, og den cytosoliske regulering vaskes ud.

Intakte celler bevarer alt: plasmamembranens barriere, cytosoliske reduktionsmidler, endogen substrattransport, mitokondrienetværket og ATP-behovet. De er tættest på fysiologien og længst fra mekanismen, fordi optagelse, reduktion og tilbageholdelse af farvestoffet alle påvirker den effektive eksponering af mitokondrierne.

TEGDMA-studiet brugte bevidst alle tre niveauer: isolerede hjernemitokondrier til farvestoffets genopretning af oxidation og potentiale, permeabiliserede stamceller fra tandpulpa primært til at lokalisere skaden til kompleks I-koblet substratoxidation og intakte stamceller til den fysiologiske nettoeffekt af 2 uM farvestof på nedsat iltforbrug. For læsere, der sammenligner mitokondrielle måleresultater på tværs af præparater, giver den tilhørende forklaring af, hvordan methylenblåt flytter elektroner gennem respirationskæden, baggrunden for reaktionsvejene, mens guiden til læsning af respirationsstudier med methylenblåt gennemgår logikken bag doser og inhibitorer.

Kontroller, som et redoxaktivt farvestof kræver

Et stof, der indgår i redoxcykling, kræver en længere kontrolliste end en almindelig inhibitor, fordi farvestoffets egen kemi kan efterligne biologiske processer.

Ved respirometri skal der anvendes et kammer med kun buffer til at måle drift, et kammer med buffer plus farvestof uden biologisk materiale, farvestof plus eventuelle ekstracellulære reduktionsmidler i assayet og til sidst rotenon plus antimycin til at definere ikke-mitokondrielt iltforbrug i intakte celler. Bemærk, at reduceret farvestof reoxideres ved at overføre elektroner til ilt og danne hydrogenperoxid. Derfor undervurderer en blindprøve med kun farvestof uden en elektrondonor det cellefrie iltforbrug, der opstår, når NADH eller NADPH er tilgængeligt.

Til hydrogenperoxid bør kalibreret Amplex UltraRed plus peberrodsperoxidase foretrækkes frem for ikke-selektive DCFDA-farvestoffer. Verificér med katalase, og test afhængigheden af belysning, da farvestoffet er en fotosensibilisator. Studiet af hjernemitokondrier fandt, at peroxidbelastningen steg mere end fire gange ved blot 100 nM farvestof, mens elimineringen blev langsommere. Peroxid blev dannet direkte af reduceret farvestof uden superoxid som mellemprodukt. Detaljer om valg af probe og lyskontroller findes i den tilhørende artikel om måling af reaktive iltforbindelser i farvestofforsøg, og det bredere spørgsmål om, hvornår peroxid fungerer som signal snarere end belastning, behandles sammen med cellulær redoxbalance og påstande om antioxidanter.

Ved påstande om reaktionsveje skal begge inhibitorbindingssteder i kompleks III testes: antimycin A ved Qi-stedet og myxothiazol ved Qo-stedet samt et slutpunkt ved kompleks IV med cyanid. Et tidligere studie af musehjerner rapporterede, at farvestoffet genoprettede rotenonblokeret, men ikke antimycinblokeret respiration, mens det senere studie af tre arter fandt delvis genopretning med begge inhibitorer og evidens for direkte reduktion af cytokrom c. Betragt omgåelsen som forenelig med de nyere data snarere end endeligt fastslået, eftersom farvestofkoncentration, inhibitorbindingssted, substrattilstand og farvestoffets fordeling alle ændrer den observerede rute.

Matrix til valg af assay

Brug denne tabel til at vælge målingen ud fra spørgsmålet, ikke omvendt.

En minimalt overbevisende påstand kræver, at de samme farvestofkoncentrationer, 100 nM, 300 nM, 1 uM og 2 uM, undersøges for iltflux under lækage-, ADP-, oligomycin- og afkoblerbetingelser, ATP-syntesehastighed, membranpotentiale med helst to prober og kalibreret peroxidfrigivelse med katalase og cellefrie kontroller. Rapportér det sammenhængende sæt: iltflux plus ATP-hastighed plus ATP pr. ilt plus potentiale plus peroxid. Hvert af disse tal alene er en måling, der leder efter en betydning.