Hvorfor methylenblåt bruges som modfarve ved syrefast farvning

En laborant undersøger et sputumudstryg efter hele farvningsforløbet. Røde stave træder frem mod en blå baggrund, og svaret afgives som syrefaste stave påvist. Den næste dag viser et andet objektglas en ensartet blå baggrund uden røde stave, og det rapporteres som negativt for tuberkulose. Det ene af disse svar siger mere, end objektglasset giver grundlag for, og det er ikke det første.

Forvirringen skyldes en begrebsmæssig misforståelse. Laboranten betragtede det blå farvestof som en del af påvisningens kemi, som om methylenblåt hjalp med at finde mykobakterierne. Det gjorde det ikke. Når methylenblåt kommer på objektglasset, er selve testen allerede overstået. Farvestoffet farver kun baggrunden, så resultatet kan aflæses. Denne artikel forklarer formålet med methylenblåt ved syrefast farvning, hvorfor det er blåt frem for en anden farve, og hvilke konklusioner rødt mod blåt giver grundlag for.

Det korte svar

Syrefast farvning er en differentialtest bygget på tre principper. Carbolfuchsin, den primære farve, tvinges ind i alle celler, også mykobakterier med voksagtig cellevæg. Syre-alkohol, affarvningsmidlet, fjerner det røde farvestof fra almindelige celler, men kan ikke trække det ud af syrefaste celler. Methylenblåt, modfarven, farver derefter alt det, affarvningsmidlet har tømt for farve, så ikke-syrefaste celler, værtsceller og celleaffald fremstår blå, mens syrefaste stave forbliver røde. Modfarven skaber kontrast. Den spiller ingen rolle i den kemi, der gør en celle syrefast.

Hvad hvert trin gør

Diagrammet nedenfor viser arbejdsfordelingen. Læs det fra venstre mod højre som en procedure, og læs den nederste stribe som en påmindelse om, at hver farvningstype besvarer et forskelligt spørgsmål.

Indtrængning kommer først. Mykobakterier modstår almindelige vandige farvestoffer, fordi deres cellehylster er usædvanligt hydrofobt, så protokollen tvinger farvestoffet ind. I Ziehl-Neelsen-metoden driver dampopvarmning phenolholdigt carbolfuchsin gennem den voksagtige væg. I Kinyouns kolde metode erstattes varmen af en langt stærkere formulering af den primære farve, og nogle modificerede versioner uden opvarmning tilsætter overfladeaktive stoffer. American Society for Microbiologys protokoller for syrefast farvning dokumenterer begge formuleringer side om side, og koncentrationsforskellen er markant: omtrent 0.3 g basisk fuchsin pr. 100 mL til metoden med opvarmning mod cirka 4 g til den kolde metode.

Differentiering kommer dernæst. Syre-alkohol, typisk 3 mL koncentreret saltsyre i 97 mL 95 procent ethanol, vasker det røde farvestof ud af alle celler, hvis væg ikke yder særlig modstand. Celler med et intakt mykobakterielt lipidhylster holder fast på farvestoffet. Det er det trin, hele metoden afhænger af, og det trin, der er mest følsomt over for udførelsen, som beskrevet nedenfor.

Kontrast kommer til sidst. Objektglasset indeholder nu røde syrefaste celler på en næsten farveløs baggrund af celler, der har mistet farven. Methylenblåt i en koncentration på 0.3 procent w/v gør denne baggrund synlig igen med en farve, der ligger så langt fra rød som muligt. Modfarvningen er kortvarig, typisk 20 til 30 sekunder i metoden med opvarmning og op til nogle få minutter i visse varianter af den kolde metode. Tiden afhænger af protokollen og er ikke en egenskab ved selve farvestoffet.

Hvorfor dette farvestof, og hvorfor blåt

Methylenblåt er et kationisk basisk farvestof, hvilket betyder, at dets farvede ion har en positiv ladning og binder sig til de negativt ladede overflader på affarvede bakterier, værtsceller og celleaffald. OpenStax Microbiology beskriver denne ladningsmekanisme som det generelle princip bag basiske farvestoffer. Men methylenblåt er ikke kemisk enestående i denne sammenhæng. Krystalviolet og safranin er også basiske farvestoffer. Valget er optisk, ikke kemisk.

Røde stave kræver en baggrund i en kontrasterende farvetone, og blå giver den mest nyttige kontrast til rød ved lysfeltsmikroskopi. Safranin ville være en dårlig modfarve, fordi dets endelige lyserøde til røde farve ligger for tæt på tilbageholdt carbolfuchsin og dermed udvisker netop den forskel, proceduren har skabt. Krystalviolet ville give en mørkviolet baggrund, der konkurrerer med tynde røde stave om opmærksomheden. Det stærkeste tegn på, at opgaven handler om kontrast frem for kemi, er muligheden for udskiftning: Grønne modfarver som malakitgrønt og brillantgrønt bruges i nogle veterinære og modificerede protokoller, og testen virker stadig, fordi enhver tydeligt anderledes farvetone udfører den samme opgave.

Det giver to praktiske konsekvenser. For det første angiver standardopskriften ingen pH-justering; forveksl ikke denne almindelige vandige opløsning på 0.3 procent med alkaliske formuleringer som Loefflers methylenblåt, der hører til et andet farvningsprincip. For det andet skader overdreven farvning. Histologisk litteratur advarer specifikt om, at en alt for tæt blå baggrund kan skjule fåtallige stave, så at lade farvestoffet dække objektglasset længere, end protokollen tillader, forringer aflæseligheden uden nogen gevinst.

Cellevæggens kemi, som gør testen mulig

Årsagen til, at syre-alkohol kan skelne mellem cellerne, ligger i mykobakteriernes cellehylster. Dets strukturelle kerne er mykolyl-arabinogalaktan-peptidoglykan-komplekset: peptidoglykan bundet til arabinogalaktan, hvis ydre ender bærer mykolsyrer med meget lange kæder, der danner en lipidrig ydre mykomembran med usædvanligt lav permeabilitet. Oversigtsartiklen om mykobakteriernes ydre membran beskriver denne opbygning i detaljer. Barrieren virker i begge retninger. Den modstår farvestoffets indtrængning, hvilket er grunden til, at indtrængningen kræver varme eller en stærkere primær farve, og den modstår udtrækning af farvestoffet, hvilket er grunden til, at syre-alkohol ikke kan fjerne carbolfuchsin, når det først er kommet ind. Almindelige bakterier mangler dette cellehylster og mister farvestoffet. Syrefasthed forstås derfor bedst som et lipidbarrierefænomen, ikke som fuchsin, der binder sig kemisk til mykolsyre.

Denne kemi forklarer også et almindeligt spørgsmål: Mykobakterier farves dårligt og uforudsigeligt med Gram-metoden og fremstår undertiden som svagt farvede former med perlelignende mønster eller som ufarvede skygger. Deres hydrofobe væg begrænser krystalviolets indtrængning. Syrefast farvning er ikke en modificeret Gram-farvning. Den bygger på et andet differentieringsprincip omkring en anden egenskab ved cellevæggen, som sammenligningen af simpel farvning og Gram-farvning viser for de to andre metoder.

Tre metoder, tre spørgsmål

Se atlasset over farvning til mikroskopi for den bredere gruppe af bakteriefarvningsmetoder med ét farvestof.

Hvad rødt mod blåt ikke kan bevise

Røde stave betyder, at organismerne beholdt carbolfuchsin under behandlingen med syre-alkohol. Det fund er foreneligt med Mycobacterium tuberculosis, men CDC's vejledning om diagnosticering af tuberkulose bemærker udtrykkeligt, at andre mykobakterier også er syrefaste. Artsidentifikation kræver derfor dyrkning og nukleinsyretest, ikke farve.

Tekniske fejl samler sig omkring de to skylletrin. Utilstrækkelig affarvning efterlader baggrundsmateriale rødt og øger risikoen for falsk positive aflæsninger. Overdreven affarvning fjerner svagt tilbageholdt primær farve og bidrager til falsk negative resultater. For kraftig modfarvning skjuler fåtallige stave i blåt. Tykke udstryg, udfældede reagenser og forurenet skyllevand tilføjer deres egne artefakter.

Sensitiviteten er begrænset af mængden af organismer, uanset hvor korrekt teknikken udføres. Konventionel udstrygningsmikroskopi kræver omtrent 5,000 til 10,000 stave pr. milliliter sputum, og ældre evidensgennemgange fra CDC angav udstrygets sensitivitet til omkring 45 til 80 procent blandt dyrkningsbekræftede lungetuberkulosetilfælde. Et negativt udstryg udelukker derfor aldrig tuberkulose. Aktuel CDC-vejledning fastholder dyrkning sammen med hvert udstryg og anbefaler nukleinsyreamplifikationstest på mindst én luftvejsprøve, når lungetuberkulose overvejes, og resultatet ville ændre håndteringen.

Praktisk arbejde skal følge godkendte protokoller

Undervisningsbeskrivelser, herunder denne artikel, giver ikke tilladelse til klinisk arbejde. Ved praktisk laboratoriearbejde skal laboratoriets validerede standardprocedure følges i overensstemmelse med aktuelle dokumenter fra CDC, APHL eller CLSI; CDC's reference for syrefast farvning i Stacks-arkivet viser, hvordan sådanne procedurer specificerer reagenser og aflæsning. Arbejde med tuberkuloseprøver kræver indeslutning: Udstryg fremstilles i et biologisk sikkerhedskabinet, fordi forberedelsen danner aerosoler og stænk, og CDC's vejledning om laboratoriesikkerhed angiver, at selv varmefikserede udstryg kan indeholde levedygtige tuberkelbakterier og stadig skal håndteres som kontaminerede. Opslaget i CDC Public Health Image Library om et udstryg farvet med carbolfuchsin og methylenblåt og undersøgt for M. leprae er en nyttig påmindelse om, at metoden rækker ud over tuberkulose: Den samme rødt-mod-blåt-kontrast bruges, hvor der søges efter syrefaste organismer, og en omhyggelig negativ aflæsning er i sig selv et resultat, der er værd at registrere.

Aflæsning af det færdige præparat

Modfarven viser sin værdi under screeningen. En mikroskopist, der gennemgår præparatet ved lav forstørrelse, bruger først den blå baggrund til at vurdere udstrygets kvalitet: jævn cellefordeling, intakte værtsceller til fokusering og ingen kraftige udfældninger. Røde kandidater fanger derefter blikket, netop fordi intet andet på objektglasset er rødt. Bekræftelsen sker under olieimmersion, hvor ægte stave viser den forventede tynde, undertiden let buede eller perlelignende form frem for ensartede farvestofrester.

Baggrundsfarvningen fastlægger også ordvalget i svaret. Et objektglas med røde stave rapporteres som syrefaste stave påvist, ofte med en semikvantitativ gradering efter laboratoriets skala. Et objektglas uden røde organismer rapporteres som ingen syrefaste stave påvist, aldrig som negativt for tuberkulose. Forskellen er vigtig, fordi den blå baggrund viser, at farvningen virkede, at cellerne optog modfarven, og at optikken var tilstrækkelig, men ikke siger noget om organismer under påvisningsgrænsen. En blå baggrund uden fund er et gyldigt resultat om præparatet, ikke en afgørelse om patienten.

Husk arbejdsfordelingen, så giver svarene sig selv. Carbolfuchsin påviser kandidater. Syre-alkohol udfører testen. Methylenblåt gør kun svaret læseligt: Rødt beholdt farvestoffet trods syren, blåt mistede det. Alt andet, art, mængde og klinisk betydning, kommer fra undersøgelser ud over objektglasset.