Methylenblåt som anaerob- og iltindikator: hvad farveskiftet beviser

En tekniker lukker en anaerobekrukke tæt, kontrollerer indikatorstrimlen med methylenblåt gennem låget og ser det, hun gerne vil se. Strimlen er gået fra blå til hvid. Hun registrerer forsøget som anaerobt og går videre. To dage senere er der ingen vækst på én plade, mens et lukket rør med flydende dyrkningsmedium i samme krukke viser tegn på iltpåvirkning. Strimlen fortalte sandheden. Hun stillede den det forkerte spørgsmål.

Forvirringen skyldes en begrebsforveksling. En anaerob indikator med methylenblåt handler om redoxforhold, ikke om sterilitet og heller ikke om validering af hele systemet. Når den forskel står klart, bliver strimlen et præcist og pålideligt instrument med en snævert afgrænset opgave.

Princippet: et reversibelt redoxpar

Opløst methylenblåt findes i to tilstande. Den oxiderede form er den velkendte blå kation. Den reducerede form, kaldet leukomethylenblåt, er farveløs. Ved næsten neutral pH består den forenklede halvreaktion af én blå kation plus én proton plus to elektroner, som giver ét farveløst leukomolekyle. Det formelle potentiale ligger omkring plus 11 millivolt i forhold til standardbrintelektroden ved pH 7. Det placerer det i et område, som mange reducerende systemer kan nå, og hvor ilt kan vende reaktionen.

Reduktion kræver et lavt lokalt redoxpotentiale. Det er ikke altid nok blot at fjerne ilten. Tidligt arbejde med anaerobe forhold viste, at methylenblåt i rent, iltfrit vand bevarede sin farve, medmindre der var et reducerende stof til stede. Blandinger af dextroseholdigt dyrkningsmedium med omkring 0.01 procent farvestof blev let affarvet ved 37 C, mens samme blanding ved 4 C forblev blå i et døgn, som beskrevet i forsøg med frisk væv og anaerobe dyrkningsforhold. Temperatur, pH, glukose, ascorbat, thioglykolat og mikrobiel reducerende aktivitet er alle med til at afgøre, om elektronerne er tilgængelige.

Reoxidation kræver kun ilt. Når luft når leukoformen, bliver den blå igen. Moderne, specialudviklede indikatorer udnytter netop denne cyklus: farvestof plus reduktionsmiddel plus en stabiliserende matrix, farveløs ved lavt iltindhold og blå igen ved kontakt med luft, som demonstreret i en hybrid iltindikator med methylenblåt baseret på farvestof, reduktionsmiddel, overfladeaktivt stof og ler. Denne prototype brugte 0.01 millimolært farvestof med 2.0 millimolært ascorbat eller glukose ved pH 11, blev farveløs nær 0.5 volumenprocent ilt og kunne skelne mellem under 0.1 procent og over 0.5 procent ilt i sit testkammer.

Funktionsprincippet er altså enkelt. Blå betyder, at indikatorzonen er oxideret. Farveløs betyder, at indikatorzonen har opnået reducerende forhold med lavt iltindhold. Ændringen er reversibel, lokal og kemisk. I sig selv siger den intet om mikroorganismer.

Sådan virker en indikatorstrimmel med methylenblåt i en anaerobekrukke

En indikatorstrimmel med methylenblåt til en anaerobekrukke er en lille reaktionszone, som placeres i krukkens atmosfære, hvor den kan ses uden at åbne beholderen. Kommercielle udformninger varierer: papirstrimler, tabletter, der opløses eller fugtes ved klargøring, og nyere hybridpapirer. Nogle kræver én dråbe destilleret vand for at aktivere reaktionszonen. Andre er tørre indikatorer, som skal forblive tørre. Brugsanvisningen til det konkrete produkt er afgørende, fordi fugtning, placering og aflæsningstidspunkt er en del af kemien.

I praksis er den tilsigtede aflæsning binær. Blå betyder, at der stadig er ilt eller utilstrækkeligt reducerende forhold ved strimlen. Hvid eller farveløs betyder, at anaerobe redoxforhold er etableret ved strimlen. Enkelte kommercielle indikatorpapirer indeholder et rødt baggrundspigment, så deres reducerede sluttilstand fremstår lyserød i stedet for hvid. Kend den sluttilstand, dit produkt angiver, før du vurderer det.

Tidsforløbet varierer mellem systemer. I én opstilling af GasPak-typen begyndte farven at aftage inden for omkring en time og var helt væk inden for få timer, mens methylenblåt krævede mere end seks timer i en kontrolleret sammenligning ved stuetemperatur. I dette arbejde nåede mediernes redoxpotentiale omkring minus 100 millivolt inden for 60 til 100 minutter, længe før farvestoffet var færdigt med at skifte farve, og lå et godt stykke under minus 200 millivolt, da strimlen blev helt farveløs. Indikatoren reagerer langsommere end atmosfæren ændrer sig. En blå strimmel efter én time beviser ikke, at systemet har svigtet, og en hvid strimmel efter seks timer beskriver strimlen på det tidspunkt.

Placeringen er vigtig af samme grund. Hold strimlen i gasrummet, synlig gennem låget og væk fra agaroverflader og dyrkningsmedier. Den viser forholdene i sit umiddelbare miljø. Lægger du den fladt mod en kold væg, gemmer den under plader eller lader kondensvand gennemvæde den, viser den dette mikromiljø i stedet for krukkens atmosfære.

Hvad strimlen viser, og hvad den ikke viser

Betragt indikatoren med methylenblåt i anaerobekrukken som én sensor på ét sted. Den påviser lokale redox- og iltforhold i sin egen reaktionszone, som i store træk er repræsentative for gasrummet, hvis opblanding og ligevægtsindstilling er tilstrækkelige. Alt derudover er en slutning, og slutninger kræver særskilt dokumentation.

En farveløs strimmel påviser ikke sterilitet. Sterilitet er fravær af levedygtige organismer, dokumenteret ved valideret sterilisering og kontroller til validering af dyrkning. En krukke kan være fuldstændig anaerob og stadig kontamineret eller fuldstændig steril og stadig aerob.

Den validerer ikke alle dele af dyrkningssystemet. Opløst ilt i et lukket rør, ilt fanget i dybe agarlag, gradienter i en tætpakket krukke og en utæthed, der opstår efter aflæsningen, undgår alle registrering med én strimmel. Forsøg med rumlig fordeling viste tilstødende blå og farveløse zoner i samme beholder, hvor iltindtrængning og reducerende aktivitet var i forskellig balance. Ét punkt kan ikke bekræfte forholdene i et helt volumen.

Den beviser ikke uafbrudte anaerobe forhold. En strimmel, der aflæses én gang ved klargøring, siger intet om forholdene efter tyve timer. Nyere kvalitetsarbejde med anaerobe forhold advarer om, at kemiske indikatorer beskriver atmosfæren i det øjeblik, de aflæses, og kan se tilfredsstillende ud trods en lille mængde restilt. Det er løbende dokumentation eller dokumentation ved kontroltidspunkter, ikke et enkelt blik på sluttilstanden, der knytter strimlen til inkubationsforløbet.

Læs om den tilhørende kemi bag farveskiftet i hvordan methylenblåt skifter mellem oxiderede og reducerede tilstande. Læs om iltkontrol i mikroskopi- og dyrkningsarbejde for at forstå, hvordan ilt mere generelt påvirker prøvehåndtering.

Et diagram til at have ved siden af krukken

Figuren nedenfor samler artiklen i én oversigt til laboratoriebordet. Tre tilstande af samme strimmel, reaktionens to retninger og grænsen mellem indikatorens dokumentation og validering af systemet.

Fejltyper, der holder strimlen blå eller giver falsk tryghed

De fleste fejl falder i fem grupper. Hver har sine karakteristiske tegn.

En utæt krukke eller pose bliver ved med at tilføre ilt til reaktionszonen. Strimlen forbliver blå eller bliver blå igen, efter at farven er aftaget. Kontrollér låg, pakning, klemmer og tætningsflader, før du giver kemien skylden.

En opbrugt eller forkert aktiveret gasgenerator fjerner aldrig ilten. I ældre vandaktiverede systemer var manglende kondens efter omkring 10 til 15 minutter og manglende opvarmning af låget efter omkring 20 til 40 minutter tidlige advarselstegn for det pågældende system. En for lille pose i en overfyldt krukke svigter på samme måde.

En forgiftet katalysator er kun relevant for ældre systemer med brint og palladium, hvor palladium får brint og ilt til at reagere og danne vand. Fugt og svovlbrinte forringer den. Mange nuværende poser bruger slet ikke palladium, så anvend ikke denne løsning, hvor den ikke hører til.

En nedbrudt eller forkert håndteret strimmel svigter uden tydelige tegn. Farvestof og reduktionsmiddel mister deres reversibilitet under opbevaring, hvilket er en af grundene til, at hybridformuleringer blev udviklet til at modstå lysbetinget afblegning og tab af funktion under opbevaring. Kassér udløbne produkter, produkter med unormal startfarve og strimler, der er blevet fugtet, selv om de skal være tørre, eller er efterladt tørre, selv om de skal fugtes.

En gradient eller forsinkelse vildleder den, der aflæser, snarere end at få kemien til at svigte. Dårligt opblandet gasrum, lukkede rør med opløst ilt og halvfaste medier bevarer hver især deres egne forhold længere, end strimlen antyder. Resazurinstrimler går gennem lyserød til farveløs og markedsføres ofte som hurtigere, men deres tærskler afhænger af deres egen formulering og kan ikke overføres til methylenblåt.

Kontroller og en aflæsningsprotokol, der er værd at kopiere

To billige kontroller fanger de fleste fejlaflæsninger. Hold en frisk kontrolstrimmel i rumluft ved siden af forsøget. En fungerende strimmel med methylenblåt forbliver blå dér. Nogle emballerede indikatorer er blege fra starten og bliver blå ved åbning, hvilket i sig selv er en funktionskontrol. Placér også med jævne mellemrum en frisk strimmel i en tidligere valideret anaerob opstilling. Den skal nå den validerede reducerede sluttilstand inden for den tid, der er angivet for produktet. Hvis en af kontrollerne ikke reagerer som forventet, skal du udskifte partiet, før du stoler på aflæsningerne i krukken.

Aflæsningsprotokollen følger af mekanismen. Placér strimlen i gasrummet, hvor den kan ses uden at åbne krukken, og følg produktets brugsanvisning om vægkontakt og fugtning. Registrér startfarven, tidspunktet for tæt lukning af krukken og farven ved det kontroltidspunkt, der er angivet for produktet. Hvor beholderen tillader det, skal du ved fastlagte kontroltidspunkter under inkubationen registrere, at indikatoren fortsat er reduceret. Registrér slutfarven umiddelbart før åbning. Farven før åbning er slutresultatet for det pågældende forsøg. Forvent, at strimlen bliver blå igen efter åbning, og lad ikke dette ændre den tidligere vurdering.

Hvis strimlen forbliver blå efter den angivne tid, skal de anaerobe forhold betragtes som ubekræftede. Gennemgå kæden i rækkefølge: tætning, pose, katalysator hvis til stede, indikatorens fugtning og udløbsdato og derefter indikatorens funktion sammenholdt med kontrollen i luft. Først når atmosfæren er bekræftet, bør vækst eller manglende vækst fortolkes med en anaerob dyrkningsopstilling og organismekontroller, der passer til anvendelsen.

Strimlen fortjener det sidste ord inden for sit eget område. Blå eller farveløs besvarer den ét spørgsmål om ét sted på ét tidspunkt. Stil den dette spørgsmål på de planlagte tidspunkter med kontroller ved siden af, så svarer den pålideligt. Spørg den om sterilitet, om alle rør eller om hele inkubationsforløbet ud fra et enkelt blik, og ingen indikatorkemi kan redde fortolkningen.