Artikel
Methylenblåt og nitrogenmonoxid: NOS, cGMP og vaskulær signalering
Spørgsmålet lyder enkelt: Hæmmer methylenblåt nitrogenmonoxid? I laboratoriet deler svaret sig i fire separate spørgsmål, som hver kræver sin egen eksperimentelle test. Sammenblanding af dem er hovedårsagen til, at tekster om methylenblåt og nitrogenmonoxid fremstår selvsikre, men upræcise.
Tænk på nitrogenmonoxidsignalet som en kæde med fire led. Et gen transskriberes, så nitrogenmonoxidsyntase dannes. Enzymet omdanner arginin til nitrogenmonoxid. Gassen diffunderer til sit mål, før den reagerer med noget andet. Opløselig guanylatcyklase registrerer den og danner cyklisk GMP. Der er publiceret virkninger af methylenblåt ved hvert led, men evidensen stammer fra forskellige forsøgspræparationer, forskellige koncentrationer og forskellige isoformer. Et resultat ved ét led beviser ikke en virkning ved et andet.
Den kanoniske kæde, forklaret enkelt
I en blodkarvæg forløber standardsekvensen sådan her. Et stimulus påvirker en endotelcelle. Endotelial nitrogenmonoxidsyntase, kaldet eNOS eller NOS3, danner en lille puls af nitrogenmonoxid. Gassen diffunderer ind i den tilstødende glatte muskelcelle, binder til hæmgruppen med reduceret jern i opløselig guanylatcyklase og fremskynder omdannelsen af GTP til cyklisk GMP. Cyklisk GMP aktiverer proteinkinase G, calciumhåndteringen ændres, og musklen afslappes.
Der findes en anden kæde, som bør holdes adskilt fra den første. Under infektion eller eksponering for cytokiner transskriberer cellerne et andet enzym, inducerbar nitrogenmonoxidsyntase eller iNOS, også kaldet NOS2. Det giver en større og mere vedvarende strøm af nitrogenmonoxid end eNOS. En tredje isoform, neuronal NOS eller nNOS, hører til i endnu en sammenhæng. Når en artikel omtaler nitrogenmonoxidsyntase uden at angive isoformen, bør man stoppe op og kontrollere, hvilken der blev målt. Oversigten over, hvordan methylenblåt flytter elektroner, fremhæver samme pointe for redoxmål generelt: Relæet gør intet på egen hånd, og partneren i hver ende afgør udfaldet.
Målt cyklisk GMP er også et integreret mål, ikke en direkte enzymanalyse. Niveauet afspejler syntese via cyklase minus nedbrydning via fosfodiesteraser, især PDE5 i vaskulær glat muskulatur. Et fald i cyklisk GMP betyder derfor, at mindre signal nåede frem til detektoren. Det angiver ikke i sig selv, hvilket led der svigtede.
Led 1: Der dannes mindre iNOS-enzym
I musemakrofager stimuleret med bakterielt lipopolysakkarid, interferon gamma eller begge dele forhindrede methylenblåt den forventede stigning i iNOS-protein og reducerede kraftigt mængden af iNOS-messenger-RNA i forsøgene med transskription i makrofager. Det informative er, hvad der ikke ændrede sig. Nedbrydningen af inhibitoren I kappa B alfa, fosforyleringen af NF kappa B og STAT1 samt disse faktorers bevægelse ind i cellekernen forblev stort set intakte. Det, der faldt, var deres binding til DNA, hvilket blev bekræftet ved kromatinimmunpræcipitation, som viste reduceret binding ved iNOS-promotoren.
Det er en genregulerende effekt, som ligger før ændringen i enzymmængde, ikke en akut blokade af et eksisterende enzym. Den hører til inflammatorisk signalering, hvor transskriptionsfaktorer skal binde til en promotor, før proteinet dannes. Den siger ikke noget direkte om konstitutiv eNOS i et kar i hvile og bør beskrives med den afgrænsning.
Led 2: Det eksisterende NOS-enzym arbejder langsommere
Et rottestudie undersøgte et andet niveau. Vågne hanrotter fik lipopolysakkarid intravenøst og derefter, tre timer senere, enten saltvand eller methylenblåt i en dosis på 3 mg pr. kg intravenøst. Aktiviteten af nitrogenmonoxidsyntase i den mediale basale hypothalamus blev målt ved omdannelsen af mærket arginin til citrullin i studiet af NOS-aktivitet i hypothalamus. Stress sammen med saltvand alene inducerede en vis calciumuafhængig aktivitet, og lipopolysakkarid øgede den til omkring ti gange kontrolniveauet. Methylenblåt eliminerede begge inducerede komponenter. Calciumafhængig konstitutiv aktivitet ændrede sig ikke i det pågældende væv ved den dosis og på det tidspunkt.
Læs resultatet præcis som beskrevet: reduceret målt aktivitet af iNOS-typen under disse betingelser. Det er ikke en måling af genekspression, og det er ikke et bevis for vedvarende selektivitet for iNOS frem for eNOS eller nNOS. Arbejde med oprensede enzymer understreger behovet for forsigtighed. I direkte analyser af oprenset nitrogenmonoxidsyntase blokerede methylenblåt fuldstændigt citrullindannelsen ved 30 mikromolar, med en koncentration for halv hæmning på omkring 5.3 mikromolar uden superoxiddismutase og 9.2 mikromolar med enzymet, som rapporteret i sammenligningen af oprenset NOS og guanylatcyklase. Et separat studie af oprenset nNOS pegede på oxidation af enzymbundet hæm. Den praktiske lære er, at direkte NOS-hæmning er reel i isolerede systemer, men resultatet fra hypothalamus kan ikke udvides til en generel påstand om, at methylenblåt skåner al konstitutiv NOS overalt.
Led 3: Nitrogenmonoxid går tabt, før det når frem
Den tydeligste demonstration af, at noget andet end enzymblokade kan forklare et fald i cyklisk GMP, kommer fra dyrkede glatte muskelceller fra kaniners lungearterier. Forsøgsdesignet omgik endogen NOS fuldstændigt ved at tilsætte nitrogenmonoxiddonorer direkte og undersøgte derefter, om methylenblåt stadig dæmpede responsen i cyklisk GMP i studiet af superoxid i vaskulær glat muskulatur.
Tre donorer blev testet fra 1 til 100 mikromolar: S-nitroso-L-cystein, natriumnitroprussid og en stabil deamineret analog kaldet MPANO. Alle øgede cyklisk GMP til mellem omtrent 1.5 og 12 gange udgangsniveauet. Methylenblåt ved 10 mikromolar hæmmede de første to med 51 til 100 procent og lod MPANO-responsen være uændret. Hvis methylenblåt blot blokerede cyklasens katalytiske sted, ville denne donorselektivitet være svær at forklare, fordi alle tre virker gennem det samme efterfølgende enzym.
Tre kontrolforsøg knyttede derefter mekanismen til superoxid. For det første genskabte dannelse af ekstracellulært superoxid med xanthin og xanthinoxidase det samme mønster: CYSNO og nitroprussid blev blokeret, mens MPANO blev skånet. For det andet medførte methylenblåt dosis- og tidsafhængig superoxidproduktion fra de glatte muskelceller, målt ved reduktion af cytokrom c. For det tredje forhindrede superoxiddismutase hæmningen fuldstændigt, mens katalase ikke gjorde det. Det peger på superoxid frem for hydrogenperoxid som den umiddelbart ansvarlige kemiske art i denne forsøgspræparation.
Samdyrkningsversionen af forsøget er værd at beskrive, fordi den placerer effekten i rummet. Endotelceller på dækglas blev kortvarigt samdyrket med glatte muskelceller, så basalt frigivet endotelfaktor øgede cyklisk GMP i de glatte muskelceller til tre til otte gange udgangsniveauet. Forbehandling af enten det ene eller det andet cellekompartment med methylenblåt reducerede signalet, og superoxiddismutase ophævede delvist effekten af endotelcellernes forbehandling. Med andre ord behøver methylenblåt slet ikke at virke inde i den glatte muskelcelle, der registrerer signalet. Det kan dæmpe signalet ved at fjerne signalstoffet undervejs. Vejledningen til at læse forskning i methylenblåt behandler dette som en generel regel: Angiv det kompartment, hvor indgrebet fandt sted, før du angiver et molekylært mål.
Det ville være forkert at kalde dette NOS-hæmning. Intet syntasetrin var nødvendigt for, at donorerne kunne virke, og alligevel faldt signalet.
Led 4: Selve detektoren reagerer mindre
Der findes direkte effekter på opløselig guanylatcyklase, men koncentrationerne har betydning. I sammenligningen af oprensede enzymer, der er citeret ovenfor, krævede nitrogenmonoxidstimuleret cyklase omkring 60 mikromolar methylenblåt for halv hæmning, mod omkring 5 til 9 mikromolar for halv hæmning af NOS, og selv 1 millimolar gav kun en delvis maksimal blokade. Det er en forskel på omtrent seks til elleve gange. Et celleforsøg, der sænker cyklisk GMP ved en lav mikromolar koncentration, kan derfor ikke betegnes som selektiv cyklasehæmning alene på grundlag af værdien for cyklisk GMP.
Et senere redoxstudie tilføjede endnu et forbehold: Methylenblåt deaktiverede nitrogenmonoxidaktiveret cyklase via en mekanisme, der adskilte sig fra simpel luftoxidation af hæmjernet. Detektoren kan altså svækkes, men kemien er ikke afklaret, og koncentrationsforskellen betyder, at superoxid- og NOS-effekter bør udelukkes først ved lave mikromolare eksponeringer. Det er også her, kontrol af fosfodiesteraseaktivitet hører hjemme. Medmindre nedbrydningen blev målt eller blokeret, er reduceret ophobning af cyklisk GMP forenelig med mindre syntese, hurtigere nedbrydning eller begge dele.
Hvorfor dette ikke kan reduceres til én påstand om blodtryk
Hvert led blev påvist i et forskelligt system. Transskription i makrofager er ikke det samme som enzymaktivitet i hypothalamus. Aktivitet i hypothalamus efter lipopolysakkarid er ikke det samme som endotelial tonus i hvile. Basalt frigivet endotelfaktor i samdyrkning er ikke det samme som agoniststimuleret vasodilatation. Dyrkede lungearterieceller ved 10 mikromolar methylenblåt er ikke et menneskeligt kredsløb. Hvis man samler det hele i en påstand som, at methylenblåt hæver blodtrykket ved at blokere nitrogenmonoxid, kasserer man netop de skel, kontrolforsøgene var udformet til at bevare.
Tre kontroller holder fremstillingen redelig. For det første skal isoformen angives: eNOS for vaskulær tonus i hvile, iNOS for induceret inflammatorisk strøm af nitrogenmonoxid og nNOS for neuronale sammenhænge og visse forsøg med oprensede enzymer. For det andet skal kilden til nitrogenmonoxidsignalet angives: endogen syntese, basal frigivelse fra endotelet eller en bestemt donor som CYSNO, nitroprussid eller MPANO, da den stabile donor modstod methylenblåt, mens de labile ikke gjorde. For det tredje skal koncentrationen og den kontrol, der ophævede effekten, angives: Ophævelse med superoxiddismutase peger på superoxid, manglende effekt af katalase taler imod hydrogenperoxid i den pågældende forsøgspræparation, efterligning med xanthinoxidase viser, at superoxid er tilstrækkeligt, og analyser med oprensede enzymer adskiller direkte virkninger på katalysen fra tab under transport.
Den korte sammenfatning er denne: Methylenblåt bør snarere betragtes som et stof, der forstyrrer signaleringen fra nitrogenmonoxid til cyklisk GMP på flere steder, end som en selektiv cyklaseblokker. Afhængigt af forsøgspræparation og koncentration kan det reducere transskriptionsfaktorers binding ved iNOS, hæmme NOS-enzymer direkte, sænke tilgængeligheden af nitrogenmonoxid gennem superoxiddannelse og svække nitrogenmonoxidaktiveret cyklase. Den cykliske GMP-signalerings rolle i vaskulære studier og sammenligningen af nitrogenmonoxiddonorer anvendt i celleforsøg gennemgår hver en af disse grene mere detaljeret, og metoderne til at adskille redoxeffekter fra enzymeffekter forklarer, hvorfor superoxiddismutase sammen med katalase og en kontrol med en stabil donor optræder så ofte i denne litteratur.
En lav værdi for cyklisk GMP efter methylenblåt afslører en brudt kæde. Kun kontrolforsøgene viser, hvilket led der brød.