Methylenblåt og lyseksponering: bølgelængde, irradians og behandlingsgeometri

To artikler beskriver eksponering af methylenblåt for 10 J lys per kvadratcentimeter. Den ene dræber bakterier. Den anden giver ingen målbar virkning. En læser, der kun sammenligner dosis, konkluderer, at forskningsfeltet er inkonsistent. Forskningsfeltet er konsistent. Dosis var aldrig hele eksponeringen.

En lyseksponering er et lille system af parametre, der virker sammen: bølgelængde, irradians, varighed, den resulterende fluens, ilttilgængelighed, farvestoffets koncentration og aggregationstilstand, tidsintervallet mellem farvestof og lys samt den optiske vej, lyset faktisk bevæger sig gennem prøven. Ændr én af dem, og fotokemien ændrer sig. Denne artikel gennemgår hver parameter og skelner derefter mellem nærinfrarød fotobiomodulation og direkte fotoaktivering af farvestoffet, fordi disse to regimer oftest forveksles.

Bølgelængden afgør, om farvestoffet deltager

Methylenblåt i vand absorberer rødt lys kraftigt som monomer med et maksimum nær 664 til 665 nm og en skulder ved en kortere bølgelængde nær 610 nm, som vokser, når farvestoffet aggregerer til dimerer og større stakke. Den molære ekstinktionskoefficient nær maksimum er i størrelsesordenen 65,000 til 85,000 M-1 cm-1, så selv mikromolære opløsninger er intenst blå. Den tidlige fotokemiske oversigtsartikel om methylenblåt med DNA og biologiske substrater dokumenterer denne absorptionsadfærd og den efterfølgende kemi i den exciterede tilstand: absorption fører til en kortlivet singlettilstand, som overgår til en mere langlivet triplettilstand med rapporterede udbytter nær 0.5. I en luftmættet opløsning deaktiveres denne tilstand af ilt inden for cirka 2 mikrosekunder.

Det er i dette deaktiveringstrin, at de to fotokemiske reaktionsveje skilles. I Type II-kemi overfører farvestoffet i triplettilstanden energi til ilt i grundtilstanden og danner singletilt med ofte citerede udbytter nær 0.52. I Type I-kemi overfører triplettilstanden i stedet en elektron eller hydrogen til et substrat og danner radikaler, herunder superoxid- og hydroxylforbindelser. Begge kan foregå samtidig, og den konventionelle fotodynamiske effekt er fortsat stærkt iltafhængig, selv når Type I bidrager.

Konsekvensen for valget af bølgelængde til methylenblåt er en enkel regel. Rødt lys fra cirka 630 til 680 nm overlapper farvestoffets absorptionsbånd, og 660 til 665 nm ligger nær monomerens maksimum. Det kan derfor drive fotosensibilisatorkemi, hvor der er en nævneværdig mængde farvestof til stede. Nærinfrarødt lys ved 810 nm ligger langt uden for absorptionsbåndet i grundtilstanden og er derfor en dårlig bølgelængde til direkte excitation af farvestoffet. Koncentrationen komplicerer billedet på én reel måde: Når koncentrationen stiger, findes mere af farvestoffet som dimerer og aggregater, der absorberer omkring 610 nm og fotosensibiliserer mindre effektivt per molekyle. En fordobling af farvestofmængden fordobler derfor ikke effekten. Den tilhørende oversigtsartikel om methylenblåt og terapi med rødt lys behandler denne absorptionsregel som forudsætningen for enhver fotosensibiliseret reaktion.

Irradians, varighed og fluens er tre parametre, ikke én

Fluens, i J per kvadratcentimeter, er irradians ganget med tid. Hvis kun fluensen angives, skjules den hastighed, hvormed energien blev tilført, og hastigheden har betydning.

En høj irradians leveret kortvarigt og en lav irradians leveret over lang tid kan give samme fluens med forskellig kemi. Høj irradians forbruger opløst ilt hurtigere, end diffusion kan erstatte den, hvilket begrænser den iltafhængige Type II-reaktionsvej undervejs i eksponeringen. Den tilfører også varme, og væv reagerer på opvarmning med ændringer i blodgennemstrømningen, som ændrer både iltningen og farvestoffets fordeling. Lav irradians over en lang eksponering opretholder ilttilførslen, men giver reparations- og reiltningsprocesser tid til at virke under selve eksponeringen. I lærebøger om fotokemi kaldes antagelsen om, at kun den samlede dosis har betydning, for reciprocitet. Den holder ikke, når ilt, opvarmning eller biologi spiller en rolle, hvilket i væv vil sige næsten altid.

Antimikrobielle fotodynamiske eksponeringer med methylenblåt hos mennesker anvender ofte 6 til 18 J per kvadratcentimeter, hvilket overlapper værdierne for fotobiomodulation. Fluens alene kan derfor ikke identificere regimet. En eksponering på 10 J per kvadratcentimeter ved 660 nm i væv med farvestof er fotosensibilisatordrevet fotokemi. Samme fluens ved 810 nm i væv med spormængder af farvestof er noget helt andet. Tallet er det samme. Konceptet er forskelligt.

Den optiske vej og prøvegeometrien afgør, hvad lyset møder

Beer-Lamberts lov betyder, at forsiden af en prøve modtager langt mere lys end bagsiden. I en kuvette med farvestof i en koncentration på nogle titals mikromolar kan den første millimeter absorbere det meste af det indfaldende røde lys, så dybere lag reelt ikke eksponeres. Fordeles den samme opløsning i en lav brønd med et lille volumen, bliver eksponeringen næsten ensartet. Samme farvestof, samme lampe, samme fluens ved overfladen, men et andet resultat.

Væv tilføjer spredning ud over absorption. Rødt lys nær 660 nm trænger ind i størrelsesordenen millimeter, og den præcise dybde bestemmes af blodindhold, pigmentering og vævstype. Brønde tilføjer deres egne artefakter: linsevirkning fra menisken, refleksion fra væggene, skygge over kantbrønde og opvarmning af små volumener under lyskilden. To laboratorier, der angiver identiske lampeindstillinger, men bruger forskellige pladetyper, volumener eller afstande til lyskilden, har udført forskellige forsøg.

Afstanden fortjener særlig opmærksomhed, fordi den er den mest almindelige skjulte variabel. Irradiansen falder hurtigt med afstanden fra en ikke-kollimeret lyskilde. Flyttes en lampe fra 2 cm til 5 cm over pladen, kan irradiansen derfor reduceres flere gange, mens metodeafsnittet stadig beskriver det samme. Uden en målt irradians ved prøvens overflade er offentliggjorte fluensværdier beregnet ud fra producentens effektangivelser estimater, ikke målinger.

Kommenteret parameterguide: hvad gør en eksponering reproducerbar

Det originale materiale på denne side er en tjekliste. En lyseksponering i et studie, som udelader disse oplysninger, kan ikke sammenlignes med en anden, uanset hvor ens den overordnede dosis ser ud.

1. Bølgelængde og båndbredde. Maksimum og fuld bredde, ikke et farvenavn. Røde LED'er dækker 630 til 680 nm, hvor farvestoffets absorption varierer meget.
2. Målt irradians ved prøvens overflade, i mW per kvadratcentimeter. Producentens wattangivelse er ikke irradians.
3. Varighed og pulsering. Kontinuerlig kontra pulseret tilførsel, herunder pulsfrekvens og driftscyklus, hvor det er relevant.
4. Fluens beregnet ud fra de to målte parametre ovenfor, i J per kvadratcentimeter.
5. Farvestoffets koncentration, formulering og aggregationstilstand. Monomeren nær 664 nm fotosensibiliserer anderledes end aggregater nær 610 nm.
6. Interval mellem stof og lys. Minutter til timer mellem indgivelse af farvestof og bestråling, hvilket bestemmer, hvor farvestoffet befinder sig, når lyset kommer.
7. Iltning. En luftmættet opløsning kontra hypoksisk væv ændrer direkte balancen mellem Type I og Type II.
8. Geometri. Prøvedybde, volumen, beholdertype, lyskildens afstand og vinkel samt dybden af målet i vævet.

En nyttig vane ved læsning af artikler: Kontrollér først intervallet mellem stof og lys. Det afslører hensigten. Fotodynamiske forsøgsdesign bestråler bevidst væv med farvestof. Kombinationsdesign kan med vilje adskille de to, som vist nedenfor.

Nærinfrarød fotobiomodulation er ikke fotoaktivering af farvestoffet

Fotobiomodulation, normalt forkortet PBM, bruger rødt eller nærinfrarødt lys til at modulere endogen signalering uden at tilføre en fotosensibilisator. Fotodynamisk terapi, normalt forkortet PDT, anvender tre dele sammen: lys, som fotosensibilisatoren absorberer, selve fotosensibilisatoren og ilt til at skabe en kortvarig, kraftig dannelse af reaktive forbindelser, som beskadiger målet. En oversigtsartikel om mitokondrier som mål for neurobeskyttelse kobler methylenblåt med PBM, fordi de påvirker respirationen fra forskellige sider: Farvestoffet indgår i en katalytisk redoxcyklus, som understøtter elektronstrømmen, mens PBM antages at fremme frigørelsen af hæmmende nitrogenmonoxid fra cytokrom c-oxidase ved Kompleks IV. Denne enzymmekanisme bør fortsat betegnes som en hypotese.

De to mest citerede kombinationsstudier på mus bruger begge lys ved 810 nm, og netop derfor demonstrerer de ikke fotoaktivering af farvestoffet. I et studie af forbehandling før søvnmangel fik mus dagligt methylenblåt i en dosis på 0.5 mg per kg, en pulseret laser ved 810 nm hver anden dag eller begge dele før søvnmanglen. Den kombinerede forbehandling beskyttede hukommelsesrelateret adfærd og synaptiske proteiner i hippocampus, mens de enkelte behandlinger i vid udstrækning ikke gjorde det. I et studie af kronisk stress med samtidig behandling fik mus PBM ved 810 nm og 8 J per kvadratcentimeter sammen med dagligt farvestof i en dosis på 0.5 mg per kg. Laseren blev anvendt først, og farvestoffet blev injiceret to timer senere, specifikt for at undgå at bestråle væv med farvestof. Alle tre forsøgsarme ophævede indlæringsdeficitter, med en additiv fordel primært for serumkortisol og reaktive iltforbindelser i hjernen. Disse resultater undersøger to mitokondrielle interventioner anvendt sammen, en sondring, som samlingen af fotodynamiske studier fastholder ved at registrere bølgelængden for hver indikation.

Evidensen vedrørende hud ligger på den anden side. Data fra mennesker om methylenblåt kombineret med lys til huden samler sig omkring 630 til 680 nm med topisk eller intralæsionelt farvestof og med destruktion eller remodellering som formål, hvilket per definition er PDT. At citere denne fjernelse af hudforandringer som bevis for, at farvestoffet forstærker PBM, eller at citere en genoprettende effekt ved 810 nm hos mus som bevis for, at et 660 nm-panel plus farvestof er en protokol til kognition, blander regimerne sammen. Referenceartiklen om dosering og farmakologi samt guiden til sikkerhed og interaktioner uddyber de dele af dette emne, der handler om koncentration og kontraindikationer.

Navngiv konceptet, før du sammenligner tal. Bølgelængden afgør, om farvestoffet absorberer. Irradians og varighed afgør, hvad kemien gør med denne absorption. Geometrien afgør, hvilken del af prøven der overhovedet udsættes for den. To eksponeringer, der matcher på én parameter og adskiller sig på resten, er forskellige forsøg. At behandle dem som udskiftelige er den fejl, denne guide skal forebygge. Intet af dette giver grundlag for en hjemmeprotokol; lys ved en bølgelængde, som farvestoffet absorberer, kombineret med systemisk farvestof omdanner en ellers modulerende eksponering til fotosensibilisatordrevet fotokemi, som hører hjemme i kliniske hænder.