Methylenblåt, Nrf2 og mitokondriel biogenese forklaret

En bestemt sætning går ofte igen i tekster om methylenblåt: Det aktiverer Nrf2 og danner nye mitokondrier. Sætningen fremstår som én påstand, men indeholder to forskellige begreber, undersøgt i forskellige systemer og med forskellige typer evidens. Det første er en signalvej, en sensor, der aktiverer forsvarsgener. Det andet er et byggeprogram, hvor en celle fremstiller mere mitokondrielt maskineri. Et signal kan sætte byggeriet i gang, men at vise, at signalet blev udløst, er ikke det samme som at vise, at bygningen blev opført. Og at vise mere byggemateriale er ikke det samme som at vise en bedre strømforsyning. Denne artikel holder de tre ting adskilt.

Nrf2-begrebet: en sensor, ikke et skjold

Nrf2 (nukleær faktor erytroid 2-relateret faktor 2) er en transkriptionsfaktor, et protein, hvis opgave er at aktivere gener. Under hvilebetingelser holdes det i cytoplasmaet af et sensorprotein kaldet Keap1, som afleverer det til cellens nedbrydningsmaskineri, så det løbende destrueres. Når oxidanter eller elektrofiler modificerer reaktive cysteiner i Keap1, stopper nedbrydningen. Nydannet Nrf2 ophobes, bevæger sig ind i cellekernen, danner par med små Maf-proteiner og binder til DNA-sekvenser kaldet antioxidantresponselementer. Denne binding aktiverer en række forsvarsgener.

De klassiske måleparametre for denne signalvej er specifikke. NQO1 (NAD(P)H-quinondehydrogenase 1) og TrxR1 (thioredoxinreduktase 1) er blandt de mest pålidelige Nrf2-målgener. HO-1 (hæmoxygenase-1) kan induceres kraftigt, men reagerer også på andre regulatorer. Enzymer som SOD og katalase er en del af antioxidantmaskineriet, men deres niveauer styres af mange transkriptionsfaktorer, så en stigning i SOD beviser ikke i sig selv, at Nrf2 var årsagen. Den evidens, der ligger tættest på selve signalhændelsen, er ophobning af Nrf2 i cellekernen, aktivering af en ARE-reporter eller induktion af klassiske målgener, som forsvinder, når Nrf2 fjernes. Alt andet, lavere oxidantniveauer, bedre overlevelse under stress, mere glutathion, er efterfølgende effekter, som mange signalveje kan frembringe.

Det tidligste resultat med methylenblåt i denne sammenhæng ligger tæt på signalhændelsen på denne skala. Fibroblaster eksponeret for nanomolar methylenblåt viste forsinket senescens sammen med et højere indhold af kompleks IV, højere iltforbrug og induktion af fase-2-enzymerne TrxR1 og NQO1, som beskrevet i det studie, der først knyttede methylenblåt til forbedret mitokondriefunktion og forsinket senescens. TrxR1 og NQO1 er netop de klassiske Nrf2-målgener, en kritisk læser gerne vil se. Det, studiet ikke viste, var selve signalhændelsen: ingen måling af Nrf2 i cellekernen, ingen ARE-reporter og ingen kontrol med Nrf2-knockout. Den redelige fortolkning er derfor, at methylenblåt inducerer kendte Nrf2-målgener i dette system. Det er foreneligt med Nrf2-aktivering, men isolerer ikke Nrf2 som årsagen. Induktion af et målgen ligger ét trin efter selve aktiveringen.

Biogenese-begrebet: et program med tre kontrolpunkter

Mitokondriel biogenese er det program, hvorved en celle opbygger mere mitokondriel kapacitet. Det klassiske hierarki løber gennem tre kontrolpunkter. Først aktiverer koaktivatoren PGC-1alpha programmet. Dernæst driver nukleære transkriptionsfaktorer ekspressionen af mitokondrielle gener, herunder TFAM, som vedligeholder og replikerer mitokondrielt DNA. Forvirrende nok hedder en af disse faktorer NRF1, nukleær respirationsfaktor 1, og er et andet protein end Nrf2. Til sidst har cellen flere mitokondrielle genomer og mere respirationsmaskineri, hvilket kan måles som mtDNA-kopital, citratsyntaseaktivitet eller respirationskompleksernes mængde og aktivitet.

Kontrolpunkterne understøtter påstande af forskellig styrke. Mere messenger-RNA for PGC-1alpha eller TFAM viser, at programmet blev bestilt, ikke at det blev gennemført. Mere mtDNA eller mere kompleks IV-protein viser, at der er mere materiale, men ombyggede mitokondrier kan give samme billede. Bedre respiration, højere iltforbrug eller højere kompleksaktivitet viser, at funktionen ændrede sig, men funktionen kan forbedres uden nogen nye mitokondrier overhovedet. En stærk påstand om biogenese kombinerer alle tre: regulator, indhold og funktion.

Opfølgningsstudiet med fibroblaster gennemgik det meste af denne kæde. I humane IMR90-celler behandlet med 100 nanomolar methylenblåt steg forholdet mellem NAD og NADH forbigående inden for 15 minutter og vendte tilbage til udgangsniveauet inden for et døgn. Dette forbigående energisignal blev efterfulgt af forbigående fosforylering af energisensoren AMPK, derefter induktion af PGC-1alpha og af SURF1, et protein, der er nødvendigt for at samle et fungerende kompleks IV. Aktiviteten af kompleks IV blev omtrent fordoblet, oxidanter i cellerne faldt med omkring 28 procent, og telomererne blev forkortet langsommere. Hele forløbet er beskrevet i artiklen, der forbinder methylenblåts redoxaktivitet med AMPK og mitokondriel biogenese.

To detaljer i den artikel fortjener opmærksomhed, fordi det er den slags detaljer, der typisk bliver udeladt. For det første betød mønstret mere end selve tilstedeværelsen: Methylenblåt aktiverede AMPK forbigående, mens referencelægemidlet AICAR aktiverede det vedvarende, og den forbigående aktivator forsinkede senescens omkring otte gange mere effektivt. En påstand som "methylenblåt aktiverer AMPK" er derfor ufuldstændig. Den afgørende påstand er, at det aktiverer AMPK forbigående, og sammenligningen tyder på, at vedvarende aktivering ikke har samme virkning. For det andet ændrede methylenblåt ikke cellecyklussen. Det udelukker den mest banale alternative forklaring: at cellerne blot delte sig langsommere og derfor så yngre ud.

Museforsøgene: adfærd, genomer og en bevidst paradoksal udløser

Arbejdet med cellekulturer blev udvidet til dyr af en forskergruppe, der undersøgte midaldrende mus. Efter 60 dage med oral indgivelse af methylenblåt bevarede de behandlede mus mere af deres fysiske udholdenhed og udforskende adfærd og viste mindre angstlignende adfærd end ubehandlede aldrende mus. I hjernevæv blev ekspressionen af gener, som aldring havde undertrykt, NRF1, TFAM, SOD2 og kompleks IV-underenheden COX1, genoprettet i retning af niveauerne hos voksne mus, og mtDNA-kopitallet steg. Disse resultater, adfærd sammen med regulatorer og genomantal, er beskrevet i studiet af methylenblåt og mitokondriel biogenese i hjernen hos midaldrende mus.

Den foreslåede udløser er den interessante del, fordi den går imod den enkle fortælling om, at methylenblåt er en antioxidant. De behandlede mus viste øget dannelse af reaktive iltforbindelser i hjernens mitokondrier, specifikt hydrogenperoxid. Forfatternes hypotese er, at et mildt peroxidsignal aktiverer Nrf2-signalvejen, som derefter driver biogeneseprogrammet. I denne model er methylenblåt en prooxidant i det udløsende trin og en antioxidant i resultatleddet. Det er et mønster, farmakologer kalder hormese, hvor en lille belastning fremkalder et forsvar, der er større end selve belastningen. Om denne stigning i peroxid faktisk forårsager Nrf2-aktiveringen, blev ikke testet direkte. Det er den foreslåede forbindelse, ikke et målt led.

Et ledsagende studie fra samme gruppe undersøgte sikkerhedsaspektet af denne hypotese nærmere. I isolerede hjernemitokondrier øgede methylenblåt produktionen af hydrogenperoxid ved koncentrationer helt ned til 50 nanomolar, men terapeutiske koncentrationer medførte ingen påviselig skade på mitokondrielt DNA. Først ved 100 micromolar, langt over terapeutiske niveauer, viste udvalgte mtDNA-fragmenter skade. Kombinationen af 20 micromolar farvestof og rødt lys dannede singlet-ilt, som beskadigede mtDNA bredt. Det er farvestoffets kendte virkemåde som fotosensibilisator, snarere end dets farmakologi uden lys. Forbehandling beskyttede endda mitokondrier i den ventrale midthjerne mod rotenoninducerede mtDNA-skader. Dosisresponsen og kontrollerne for genotoksicitet er beskrevet i studiet af methylenblåts ikke-genotoksiske peroxidproduktion.

Målt versus foreslået: sådan læses diagrammet

Diagrammet over signalvejene nedenfor blev tegnet til denne artikel for at fastholde den skelnen, teksten har lagt vægt på. Bokse med fuldt optrukne kanter er trin med direkte eksperimentel støtte i litteraturen om methylenblåt: redoxcykling, som ændrer NAD/NADH, forbigående AMPK-fosforylering, induktion af PGC-1alpha og SURF1, højere kompleks IV-aktivitet, induktion af NQO1 og TrxR1, genoprettet ekspression af biogenesegener og mtDNA-kopital i musehjerner samt øget peroxid uden mtDNA-skade ved terapeutiske doser. Bokse med stiplede kanter er de foreslåede forbindelser: Keap1, der registrerer peroxidsignalet, ophobning af Nrf2 i cellekernen, som driver forsvarsgenerne, og årsagspilen fra Nrf2-aktivering til biogeneseprogrammet. Disse stiplede trin er plausible, forenelige med dataene og almindelig lærebogsbiologi, men i disse artikler blev de ikke målt med de kontroller (Nrf2 i cellekernen, ARE-reportere, Nrf2-knockout), der ville gøre dem til bokse med fuldt optrukne kanter.

Tre misforståelser bliver tydelige, når man har diagrammet foran sig. For det første er NRF1 og Nrf2 forskellige proteiner med næsten identiske navne. Musestudiet målte nukleær respirationsfaktor 1, en biogeneseregulator, ikke antioxidanttranskriptionsfaktoren, og hvis man blander dem sammen, reducerer man hele diagrammet til ét knudepunkt. For det andet er genekspression begyndelsen på historien, ikke slutningen. Genoprettede niveauer af TFAM- eller COX1-messenger-RNA understøtter, at biogenese blev sat i gang, mens mtDNA-kopital og kompleks IV-aktivitet er evidensen for, at processen blev gennemført. For det tredje beviser antioxidantresultatet ikke, at Nrf2 var vejen dertil. Faldet på 28 procent i oxidanter i fibroblaster og beskyttelsen mod rotenon i mus er reelle efterfølgende effekter, men flere signalveje fører til dem.

Hvad der ville gøre en stiplet boks fuldt optrukken

De manglende forsøg er standardforsøg. Måling af Nrf2-protein i cellekernen efter eksponering for methylenblåt, med et tidsforløb tilpasset det forbigående AMPK-signal, ville teste, om de to grene faktisk aktiveres samtidig, sådan som hypotesen om synkroniseret aktivering hævder. En ARE-styret reporter ville bekræfte transkriptionsaktiviteten frem for at udlede den af målgener. En gentagelse af biogenesemålingerne med Nrf2 nedreguleret eller slået helt ud ville teste årsagspilen direkte: Hvis induktionen af kompleks IV og stigningerne i mtDNA fortsat ses uden Nrf2, er forbindelsen forkert, og AMPK-grenen står alene for effekten. I dyreforsøg ville et studie med langvarig dosering og de samme tre kontrolpunkter, regulator, indhold og funktion, teste, om programmet forbliver aktivt eller tilpasser sig. Indtil da forbliver den synkroniserede aktivering af energi- og forsvarssignalveje det, forfatterne kaldte den: en mulig nøglefaktor, ikke en fastslået mekanisme.

Læsere med interesse for den bredere farmakologi vil måske have den omgivende sammenhæng: hvordan methylenblåt transporterer elektroner på mitokondrieniveau, hvad det ellers gør ved mitokondrier og cellernes energi, hvor resultaterne om senescens hører hjemme i aldringsforskningen, hvordan påstande om biogenese relaterer sig til kognitiv præstation, og den sikkerhedsdokumentation, der sætter rammerne for enhver diskussion om dosering. Hvert af disse er et særskilt begreb med sin egen evidens, og hvert fortjener den samme skelnen mellem målt og foreslået, som denne artikel har anvendt på Nrf2.