Methylenblåt og autofagi: AMPK, mTOR og neuronale forsøg

Forestil dig, at du udfører et celleforsøg, tilsætter methylenblåt og ser et proteinbånd kaldet LC3-II blive mørkere på dit blot. Det er fristende at konkludere, at stoffet "øger autofagi", og gå videre. Den fortolkning er forhastet. Et mørkere LC3-II-bånd kan betyde, at cellen danner flere oprydningsvesikler, eller at vesiklerne hober sig op, fordi nedbrydningstrinnet er blokeret. De to fortolkninger peger i modsatte retninger, og den neuronale litteratur om methylenblåt indeholder eksempler på begge typer evidens. Denne artikel gennemgår, hvad der faktisk blev målt, analyse for analyse.

Makroautofagi, den form der undersøges her, er cellens proces for genanvendelse af større mængder materiale. En membransæk kaldet en fagofor vokser omkring slidte proteiner og organeller, lukker sig til et autofagosom og fusionerer med et lysosom, hvorefter dens indhold nedbrydes og frigives til genbrug. Neuroner er afhængige af denne rutine, fordi de ikke deler sig og derfor ikke kan fortynde beskadigede dele ved celledeling. Når genanvendelsen går i stå, ophobes affald. Når den fungerer, genvinder cellen byggesten under stress.

Hvad et forsøg med hippocampusceller viste

Det centrale studie af induktion brugte HT22-hippocampusceller fra mus, som blev udsat for stress ved serumdeprivation i 24 timer. Denne tilstand fjerner vækstfaktorer og trofiske signaler og udløser både apoptose og autofagi. Forskerne rapporterede, at methylenblåt reducerede celledød på en dosisafhængig måde, og at denne beskyttelse var ledsaget af tegn på makroautofagi.

Markørmønstret var specifikt. Diffus LC3B-farvning blev omfordelt til perinukleære punkter fra omkring 20 nM methylenblåt, med den stærkeste LC3-I- og LC3-II-respons nær 1 μM. Både LC3B-I og LC3B-II steg dosis- og tidsafhængigt. Det afgørende var, at forskergruppen gik et skridt videre end et statisk LC3-blot. De tilsatte 10 μM klorokin, som blokerer lysosomal nedbrydning, og fandt højere LC3-II samt stabiliseret p62 i celler behandlet med methylenblåt. Det mønster understøtter lysosomafhængig omsætning frem for blot ophobning. De viste også, at klorokin delvist ophævede den antiapoptotiske effekt, hvilket knytter beskyttelsen til autofagi- og lysosomvejen i denne model.

Resultatet om signalering er den del, der oftest gengives forkert. AMPK-signalering, målt som fosforyleret AMPK og dets nedstrømsmål fosforyleret ACC, steg efter 12 og 24 timer på en dosisafhængig måde. AMPK-hæmmeren Compound C, anvendt ved 20 μM i de sidste 4 timer, reducerede både ACC-fosforylering og LC3-aktivering. Fosforyleret mTOR viste derimod ingen påviselig hæmning. I stressede hippocampusceller var fundet altså AMPK-knyttet induktion via en tilsyneladende mTOR-uafhængig vej. Det samme mønster viste sig i levende mus, hvor behandling med methylenblåt inducerede markører for makroautofagi i cortex og hippocampus.

Induktion er ikke gennemført flux

Her er skellet mellem begreberne særlig vigtigt. Induktion betyder, at det opstrøms maskineri danner flere autofagosomer. Flux betyder, at materialet gennemløber hele forløbet: indkapsling, modning, fusion med lysosomer, nedbrydning og genanvendelse. Enhver stigning i LC3-II er et udsagn om induktion, indtil en fluxtest bekræfter resten af forløbet.

Den almindelige fluxtest måler LC3-II med og uden en kortvarig lysosomal blokade, eksempelvis med bafilomycin A1 eller klorokin. Hvis behandlingen reelt fremskynder dannelsen, bør blokering af nedbrydningen øge LC3-II yderligere. En tandem-mCherry-GFP-LC3-reporter tilføjer en anden indgangsvinkel: Strukturerne lyser gult før fusion med lysosomer og kun rødt, efter at det sure miljø har slukket GFP-signalet. Flere rent røde punkter understøtter derfor progression til sure autolysosomer. Et fald i p62-protein kan understøtte omsætning af materialet, med det forbehold at selve p62-transkriptionen reagerer på stress og bør kontrolleres på mRNA-niveau.

Tjeklisten nedenfor knytter hver analyse, der anvendes i denne litteratur, til det, den måler, og det, den ikke kan bevise alene. Læsere kan bruge den til at vurdere enhver fremtidig påstand om makroautofagi, herunder argumenter om faste og lang levetid, der bygger på disse markører.

Bemærk en sproglig faldgrube, som tabellen beskytter mod. Fosforyleret ACC er den enzymatisk hæmmede form. En stigning viser signaloutput fra AMPK, ikke aktivering af ACC.

Formuleringen "hæmning af makroautofagi ophævede neurobeskyttelsen" kræver samme præcision. I HT22-modellen betyder den, at indgreb i autofagi- og lysosomvejen fjernede den overlevelsesfordel, som methylenblåt gav under serumdeprivation. Det understøtter, at autofagi var nødvendig eller bidragende i netop denne cellekultur. Det fastslår ikke, at autofagi er stoffets eneste beskyttende mekanisme, og det beviser ikke, at klorokin udelukkende virker gennem autofagi. Genetisk manipulation af ATG5, ATG7 eller ULK1 ville være nødvendig for at styrke påstanden om årsagssammenhæng.

To veje ind i det samme maskineri

Et forenklet kort hjælper. Energistress øger AMPK, AMPK aktiverer ULK1-komplekset, og autofagi starter. Vækstfaktorer og næringsstoffer øger mTORC1, mTORC1 hæmmer ULK1, og autofagi forbliver slået fra. Nedstrøms for ULK1 igangsætter Beclin-1- og VPS34-komplekset dannelsen af fagoforen, LC3-I lipideres til LC3-II, autofagosomet lukker sig og fusionerer med lysosomet, og materialet nedbrydes, mens p62 omsættes.

Diagrammet placerer hvert fund om methylenblåt på dette kort: hippocampusresultatet ved AMPK-grenen og progenitorresultatet ved mTOR-grenen.

Denne forståelsesramme afklarer den tilsyneladende uoverensstemmelse med det andet Xie-studie. I prolifererende neurale progenitorceller fra rotter fandt et separat forsøg, at 5 μM methylenblåt hæmmede proliferation og fremmede en hviletilstand. Antallet af Ki67-positive celler faldt på dag 1 og 3, mens differentieringen af celler, der allerede var bestemt til at blive neuroner, forblev intakt. Her gik mekanismen gennem hæmmet mTOR-signalering: reduceret samlet mTOR og fosforyleret mTOR sammen med lavere ekspression af p70S6K og 4EBP1 samt nedregulering af cyklinerne E1, B1, D1 og D2. Den dominerende fænotype var progenitorcellernes hviletilstand, som forfatterne knyttede til forsinket senescens, ikke redning af stressede hippocampusceller.

Der er ingen modstrid mellem de to artikler. AMPK og mTOR er kontekstfølsomme integratorer, ikke faste kontakter. En stresset, neuronlignende celle kan aktivere AMPK uden målbar mTOR-hæmning, mens en mitogendrevet progenitorcelle kan reagere på det samme stof ved at bremse det mTOR-afhængige vækstmaskineri. Celletype, stresskontekst, koncentration og tidspunkt afgør, hvilken gren der dominerer. Derfor hører methylenblåts virkninger på mitokondriernes energiomsætning og redoxprocesser også til i det samme billede: Som en mekanistisk oversigt over neurobeskyttelse beskriver, fungerer stoffet som en alternativ elektronbærer, aktiverer antioxidant og antiapoptotisk signalering, hæmmer MAO og NOS og er forbundet med mitokondriel fornyelse gennem biogenese og autofagi. Autofagi er én gren af en pleiotrop profil, ikke hele historien.

Hvad forsøgene ikke viser

Serumdeprivation modellerer trofisk og metabolisk stress i en cellekultur. Den modellerer ikke faste i en hel organisme: Glukose, aminosyrer og salte er stadig til stede i basalmediet, og der findes ingen fødeindtagelsesadfærd. Koncentrationer i cellekultur fra 20 nM til 5 μM kan ikke omregnes til doser for mennesker med simpel aritmetik, fordi absorption, proteinbinding, redoxtilstand, metabolisme, ophobning i væv og eksponeringstid alle er forskellige.

Intet studie på mennesker er blevet designet til at påvise autofagisk flux induceret af methylenblåt hos patienter. Den mekanistiske evidens er fortsat baseret på celleforsøg, ex vivo-forsøg og dyreforsøg, og oversigtsartikler beskriver stadig den translationelle evidens som foreløbig. Disse studier viser derfor ikke, at methylenblåt efterligner faste, forlænger menneskers levetid gennem autofagi eller gennemfører autofagisk flux i menneskehjernen. Påstande om fastelignende virkninger og lang levetid kræver deres egen kliniske evidens, og forsøg med methylenblåt hos mennesker til andre indikationer bliver ikke til autofagiforsøg alene ved association. Forskning i modeller for næringsstofrelateret stress og lang levetid bør læses med denne afgrænsning for øje.

Når du læser den næste artikel, så brug tjeklisten i rækkefølge. Spørg først, hvilken gren der ændrede sig: AMPK, mTOR eller ingen af dem. Spørg dernæst, om LC3-resultatet blev ledsaget af en fluxtest eller står alene. Undersøg så, om blokering af signalvejen fjernede fordelen, og med hvilken metode. Et studie, der besvarer alle tre spørgsmål, har grundlag for en stærk mekanistisk påstand. Et studie, der kun besvarer det første, har vist et tilladelsessignal, og resten af forløbet er stadig ikke kortlagt.