Loefflers alkaliske og polykrome methylenblåtfarvninger forklaret

Tre flasker kan stå side om side på et farvningsbord, hver mærket med en variant af methylenblåt. På den ene står der vandigt methylenblåt 1%. På den anden står der Loefflers alkaliske methylenblåt. På den tredje står der polykromt methylenblåt. En travl medarbejder griber den, der står nærmest. Udstrygningen farves så for svagt, for ensartet blå eller i uventede lilla nuancer, og prøven får skylden for resultatet.

Det er et problem med formuleringen, ikke med prøven. De tre opløsninger indeholder beslægtede farvestoffer, men bygger på forskellige farvningsprincipper. Den ene er et enkelt kationisk farvestof ved næsten neutral pH. Den anden er det samme farvestof, hvis virkning er forstærket med alkali. Den tredje er ikke længere et enkelt farvestof, men en bevidst oxideret blanding. Bruger du den forkerte, ændrer farvningsprincippet sig under arbejdet.

Det korte svar

Almindeligt vandigt methylenblåt er udgangspunktet: cirka 1% farvestof i vand, en enkel kationisk farvning til bakteriers morfologi og generel mikroskopi. Loefflers alkaliske methylenblåt tilsætter en lille, afmålt mængde fortyndet alkali til en alkoholisk stamopløsning, der fortyndes med vand. Det hæver pH og får det kationiske farvestof til at binde stærkere til sure strukturer i bakterier. Polykromt methylenblåt er methylenblåt, der bevidst er modnet ved oxidation i alkali, så flasken indeholder en blanding af demethylerede homologer (azure A, azure B, azure C), thionin og methylenviolet sammen med resterende methylenblåt. Denne blanding farver forskellige strukturer i forskellige nuancer.

Hvis du kun husker én sætning: Alkalisering ændrer farvningsintensiteten, mens polykromering ændrer farverne.

Almindeligt vandigt methylenblåt: referencepunktet

Den enkleste formulering er methylenblåt opløst i vand, typisk ved 1% w/v, uden alkali og uden oxidation. Den farvede kemiske art er methylthioninium-kationen med en chlorid-modion, et lille, fladt phenothiazinfarvestof, der i PubChems opslag om methylenblåt beskrives som methylthioniniumchlorid. Som kation binder det til nukleinsyrers fosfatrygrad og sure grupper på bakteriers cellevægge og farver cellerne blå mod en lys baggrund.

Dets styrke er forudsigeligheden. Cellekerner og bakterier fremstår blå. Kontrasten er moderat. Svagt synlige organismer kan farves svagt, og det er netop den begrænsning, Loeffler ville afhjælpe. Se en oversigt over simpel bakteriefarvning for den bredere familie af simple bakteriefarvninger, som denne opløsning tilhører. Også her er det vigtigt at holde styr på identiteten: Methylblåt er et helt andet molekyle, som methylblåt kontra methylenblåt forklarer, så en katalogsøgning alene ud fra farvens navn kan føre til den forkerte farvestofklasse.

Loefflers alkaliske methylenblåt: samme farvestof, stærkere binding

Den klassiske Loeffler-opskrift kombinerer en alkoholisk stamopløsning af methylenblåt med fortyndet alkali i vand. Lærebogsopskrifter angiver 0.3 g farvestof i 30 mL 95% ethanol plus 100 mL 0.01% vandig kaliumhydroxidopløsning (eller tilsvarende 30 mL mættet alkoholisk methylenblåt, 100 mL destilleret vand og 1 mL 1% KOH). Det giver en brugsopløsning med tæt på 0.3% farvestof ved tydeligt alkalisk pH. Kommercielle versioner følger samme princip, og Thermo Fishers katalog over mikrobiologiske farvningsmidler opfører Loefflers alkaliske methylenblåt sammen med polykrome og vandige varianter som særskilte katalogvarer med forskellige anvendelsesformål.

Alkaliet er det afgørende princip. En højere pH deprotonerer carboxyl- og fosfatgrupper i prøven og øger tætheden af negativt ladede bindingssteder, mens den ethanolbaserede stamopløsning holder farvestoffet fuldt opløst, så det når frem til disse steder i monomer form. Resultatet er hurtigere og mere intens farvning af bakterier end med et neutralt vandigt farvestof, med de velkendte dybblå stave og kokker i en almindelig bakteriologisk udstrygning. Farvningstiden er typisk et til tre minutter, efterfulgt af skylning med vand.

Den klassiske anvendelse er Corynebacterium diphtheriae dyrket på Loefflers serummedium: slanke, ofte kølleformede stave med kraftigt farvede metakromatiske Babes-Ernst-granula af oplagret polyfosfat. Kombinationen af medium og farvning er historisk; begge tilskrives den samme bakteriolog, og kontrasten i granula er den diagnostiske gevinst. Ud over arbejde med difteribakterier bruges farvningen som en generel bakteriologisk farvning til udstrygninger fra kulturer, til undersøgelse af Neisserias morfologi i kliniske udstrygninger og overalt, hvor en Gram-farvning er unødvendig, men almindeligt vandigt methylenblåt giver for svag farvning. Det er en monokrom farvning. Alle sure strukturer får en blå nuance. Når en protokol kræver differentiering ved hjælp af farver, kan alkali alene ikke levere det.

En praktisk advarsel: Alkaliske farvestofopløsninger forringes og danner bundfald under opbevaring og ved optagelse af kuldioxid. Laboratorier fremstiller enten begrænsede mængder eller køber katalogopløsningen og respekterer dens holdbarhed frem for at holde liv i en gammel flaske, der nu afsætter bundfald på hvert objektglas.

Polykromt methylenblåt: ét navn, flere farvestoffer

Polykromt methylenblåt tager udgangspunkt i det samme farvestof, men udsætter det for kontrolleret oxidation i alkali, historisk kaldet modning eller polykromering. Alkalisk ældning, opvarmning med carbonat eller oxidation med stoffer som dichromat fjerner trinvist methylgrupper fra dimethylaminosubstituenterne. Produktet er en blanding: resterende methylenblåt plus azure B (én methylgruppe fjernet), azure A og azure C (yderligere demethylering), thionin (fuldt demethyleret) og oxidative biprodukter fra methylenvioletfamilien. Hver komponent har sin egen farvenuance og affinitet til væv, så blandingen farver metakromatisk: Cellekerner, granula, muciner og brusk får hver deres blå til rødlilla toner.

Denne kemi er den samme, som ligger bag de berømte blodfarvninger. Tidlige forskere opdagede, at alkaliseret methylenblåt farvede malariaparasitters kerner i lilla nuancer, men deres vandige, modnede opløsninger var ustabile og dannede bundfald inden for få dage. Oversigten over hvordan den lilla blodfarvning blev opfundet beskriver, hvordan Malachowski og Romanowsky uafhængigt af hinanden udnyttede denne effekt i 1891, hvordan methanol blev indført for at stabilisere farvestofbundfaldet og fiksere udstrygninger uden varme, og hvordan Giemsa senere standardiserede blandingen med afmålte mængder azure B og eosin samt stabilisering med glycerol. Moderne farvninger af Giemsa-typen stammer direkte fra polykromt methylenblåt plus eosin, den kombination, der frembringer Romanowsky-effekten. Se farvninger af Romanowsky-typen og samspillet mellem azure B og eosin for flere detaljer om kombinationen med eosin og azure B-komponenten.

Fordi polykromt methylenblåt er en blanding, er det i sin natur den mindst standardiserede af de tre. Den præcise balance mellem farvenuancerne afhænger af oxidationsmetoden og oxidationens omfang. Derfor sælger leverandører til histologi det som et særskilt produkt med egen afprøvning af farvningsegenskaberne frem for som ældet Loefflers. Typiske anvendelser omfatter metakromatisk påvisning af mastcellegranula, muciner og brusk, detaljer i plasmaceller samt Helicobacter pylori i vævssnit med polykrome metoder af Goodpasture-typen. Det er det rigtige valg, når formålet er at skelne strukturer ved hjælp af farver, og det forkerte valg, når protokollen forventer en klar, monokrom bakteriesilhuet.

Sammenligning af formulering og formål

Læs tabellen som en fremgangsmåde til at træffe valget. Hvis prøven farves for svagt, så skift pH-princip og vælg Loefflers. Hvis alt farves, men intet skiller sig ud, så skift farvestofprincip og vælg polykromt methylenblåt. Hvis en Loeffler-farvet udstrygning viser granula tydeligt, men den ansvarlige spørger, hvorfor cellekerner og cytoplasma har samme blå farve, er svaret, at ingen alkalisk monokrom farvning kan løse den opgave. Det spørgsmål hører til den polykrome familie og dens afledte blodfarvninger.

Undgå de typiske forvekslinger

To fejl står for det meste af forvirringen. Den første er at behandle Loefflers som udskifteligt med almindeligt methylenblåt, fordi begge ser blå ud i flasken. De adskiller sig i pH og intensitet, og erstatter man Loefflers med et neutralt farvestof, mister man netop den kontrast i granula, som protokollen er udformet til at fremhæve. Den anden er at betragte enhver gammel eller utilsigtet ældet alkalisk blå opløsning som polykrom. Ukontrolleret ældning giver en ukendt blanding med ukendt styrke, mens egentlige polykrome opløsninger fremstilles ved definerede oxidationsmetoder og, inden for blodfarvninger, kombineres med afmålte mængder eosin. Historien er lærerig her: De ustabile vandige, modnede opløsninger fra 1890'erne blev afløst af methanolbaserede, stabiliserede formuleringer, netop fordi ukontrollerede blandinger ikke kunne reproduceres. Det er værd at huske, før man farver et objektglas til diagnostik med indholdet fra en flaske af ukendt alder.

Præcis navngivning fuldender billedet. Kontrollér katalogvaren (vandig, Loefflers eller polykrom), farvestofindholdet og den tilsigtede anvendelse på etiketten frem for at udlede det af farven. De tre formuleringer har en fælles kromofor som udgangspunkt. De har ikke samme formål.