Farvning af kindceller med methylenblåt: hvad du skal observere

En elev lægger en dråbe suspension af kindceller på et objektglas, kigger i mikroskopet og ser næsten ingenting. Nogle få blege skygger glider hen over et lyst synsfelt. Hun justerer fokus, skruer derefter op for lyset og konkluderer så, at objektglasset er tomt. Objektglasset er ikke tomt. Cellerne er der. De er næsten gennemsigtige, og netop gennemsigtigheden er det problem, denne farvning skal løse.

Det er værd at sætte ord på forskellen mellem forventning og billede, før protokollen begynder. Begyndere forventer, at et mikroskop afslører detaljer på samme måde, som et kameras zoom gør et fjernt skilt læseligt. Et lysfeltmikroskop gør noget mere afgrænset: Det viser forskelle i lysabsorption. En ufarvet kindcelle absorberer næsten intet lys og skaber derfor næsten ingen forskel. Methylenblåt tilføjer forskellen. Det binder sig ujævnt inde i cellen og omsætter struktur til kontrast. Når eleverne forstår dette princip, fremstår hvert efterfølgende trin som en konsekvens frem for en opskrift.

Baggrundsviden om, hvordan simple farvninger øger kontrasten i skolelaboratoriet, er nyttig her, og en genopfriskning af opsætning af et lysfeltmikroskop før farvning forebygger halvdelen af de mislykkede præparater. Kemien bag farven forklares i en introduktion til methylenblåt i mikroskopi, som gennemgår, hvorfor netop dette farvestof så ofte dukker op på laboratoriebordet.

Undervisningsprotokollen

Vådpræparatet nedenfor er den enklere standardmetode til almindelig undervisning. Det kræver hverken flamme eller fiksering. Varianten med fikseret udstrygning, som bruges i nogle laboratorievejledninger på videregående uddannelser, tilføjer lufttørring og kortvarig varmefiksering, som i North Central Texas Colleges øvelse med kindcelleudstrygning udgivet via Biology LibreTexts, men varmefiksering er en mikrobiologisk praksis, ikke en forudsætning for at se epitelceller.

Det skal du bruge: rene objektglas og dækglas, sterile vatpinde til engangsbrug (foretrækkes) eller nye flade tandstikkere, en dråbeflaske med 0.5 til 1 procent methylenblåt i vandig opløsning, destilleret eller deioniseret vand, sugepapir, handsker og et sammensat lysmikroskop med en samlet forstørrelse på 100x og 400x.

1. Skyl munden med rent vand. Det fjerner madrester, som ellers farves kraftigt og afleder opmærksomheden fra cellerne.
2. Hver elev tager kun en prøve fra sin egen kind. Gnid forsigtigt indersiden af kinden med en ny steril vatpind. Tryk, men skrab ikke. Stop i god tid, før der opstår ubehag eller blødning.
3. Rul vatpinden hen over midten af et rent objektglas, så der dannes et tyndt lag. Et tyndt lag er den vigtigste forudsætning for et præparat, der kan aflæses. Et tykt hvidt lag farves til en uaflæselig blå masse.
4. Tilsæt en dråbe methylenblåt over udstrygningen. Lad det virke i 1 til 3 minutter. Et minut er tilstrækkeligt i mange protokoller på videregående uddannelser; NCERT's naturvidenskabelige laboratorievejledning til klasse IX bruger omkring 3 minutter til et midlertidigt præparat. Længere er ikke bedre, og overfarvning er den mest almindelige fejl i tidsstyringen.
5. Skyl forsigtigt med destilleret vand, eller sug overskydende farvestof væk med sugepapir efter den lokale protokol. Baggrunden skal blive lyseblå, ikke dybt marineblå.
6. Sænk et dækglas skråt, så den ene kant rører først, og lad det derefter falde langsomt ned. Det holder luftbobler ude.
7. Begynd ved lav forstørrelse for at finde cellerne, kontrollér fokus og centrering, og gå derefter til 100x og til sidst 400x. Ved 400x må du kun bruge finfokuseringen.

Farvestofkoncentrationen fortjener en præcisering. Skoleprotokoller ligger typisk omkring 1 procent methylenblåt i vandig opløsning. En stærkere stamopløsning eller længere eksponering gør baggrunden mørkere hurtigere end cellekernen, hvilket vender den kontrast, øvelsen bygger på.

Sikker håndtering af kindmateriale

Kindprøver indeholder spyt og normale mikroorganismer fra munden, så behandl enhver frisk udstrygning som potentielt smittefarligt materiale, selv om donorerne er raske klassekammerater. American Society for Microbiologys retningslinjer for biosikkerhed i undervisningslaboratorier angiver de generelle principper: Vurder risikoen før undervisningen, brug handsker, beskyt øjnene, hvor der kan forekomme stænk, vask hænder bagefter, desinficér laboratorieborde, og bortskaf forurenede engangsartikler via den godkendte ordning for biologisk affald.

Fire regler i undervisningen dækker størstedelen af risikoen. Én donor pr. vatpind og pr. objektglas; de må aldrig deles. Kun prøvetagning på sig selv, aldrig på en sidemand. Engangsvatpinde og tandstikkere skal direkte i den udpegede affaldsbeholder, aldrig tilbage på laboratoriebordet. Methylenblåt farver i sig selv hud og tøj og irriterer øjnene, så brug handsker og følg almindelige hygiejneregler for farvestoffer. Udvid ikke øvelsen til dyrkning af noget fra udstrygningen, og improvisér ikke varmefiksering af frisk menneskeligt materiale uden for skolens sikkerhedsprocedure.

Hvad du skal observere, og hvorfor det ser sådan ud

Ved 100x skal du se efter brede, flade, lyseblå celler med uregelmæssigt ovale eller polygonale omrids. De ligger enkeltvis eller i løse, overlappende lag. Hver celle har normalt én mørkere blå plet. Den plet er cellekernen. Bemærk også deres placering: Pladeepitelceller er tynde fliser, ikke kugler, og derfor ligner deres kanter krakeleret glasur snarere end runde balloner.

Ved 400x kan tre kendetegn tydeligt skelnes. Cellegrænsen ses som en tynd, mørkere linje omkring cellen. Cytoplasmaet fylder det indre med en lys, ensartet blå farve. Cellekernen er mørkere og mere kompakt, ofte oval og som regel nær midten, men ikke altid. Bed eleverne registrere alle tre samt formen og forstørrelsen, for det er præcis det, elevarket spørger efter.

En vigtig præcisering er nødvendig her, og mange elevark tager fejl på dette punkt. Den synlige grænse svarer til området ved plasmamembranen, men selve membranen, et lipiddobbeltlag med en tykkelse på omtrent 7 til 10 nanometer, ligger langt under, hvad et skolemikroskop kan opløse. Det, eleverne ser, er cellens optiske kant samt farvestof, der har samlet sig dér. Det samme forbehold gælder organeller. Mitokondrier, endoplasmatisk retikulum, Golgiapparater og ribosomer er ikke synlige i dette præparat. Et almindeligt lysmikroskop kan under gode forhold opløse detaljer ned til omtrent 0.2 mikrometer, som NCBI's cellebiologiske baggrundstekst om mikroskopiske værktøjer forklarer, og størstedelen af ultrastrukturen ligger under eller nær denne grænse. Højere tom forstørrelse gør billedet større uden at tilføje detaljer.

Hvorfor farves cellekernen mørkest? Methylenblåt er et kationisk farvestof, som er positivt ladet i opløsning, og det binder sig til negativt ladet materiale i cellen, især nukleinsyrer. Kromatin koncentrerer DNA i cellekernen, så kernen optager mest farvestof. Cytoplasma indeholder RNA og andre ladede molekyler, så det farves også, men mere diffust og lysere. Det afgørende forbehold: Methylenblåt er ikke et DNA-specifikt farvestof. Forskning i fordelingen af methylenblåt ved billeddannelse af cellekerner beskriver, hvordan kationen binder sig til områder rige på nukleinsyrer, og ældre kvantitativ forskning i methylenblåts binding i cellepræparater fandt, at størstedelen af det bundne farvestof var knyttet til nukleinsyrer. En mørk cellekerne og lyst cytoplasma er derfor et kontrastmønster, ikke en molekylær analyse.

Fejl, eleverne vil begå, og hvordan de skal fortolkes

Næsten alle mislykkede præparater falder ind under et af fem mønstre. Lær eleverne at finde fejlen i præparatet i stedet for blindt at gentage forsøget.

Overfarvning gør celler og baggrund ensartet mørke, så cellekernen forsvinder i synsfeltet. Ret det med kortere farvningstid eller en grundigere skylning. Underfarvning efterlader blege skygger, som forsvinder, når lyset skrues op; forlæng tiden i trin på tredive sekunder. Tykke udstrygninger giver tætte, overlappende masser, hvor intet omrids kan følges; løsningen er mekanisk: Spred materialet tyndere næste gang, for ingen skylning kan redde en bunke celler. Luftbobler fremstår som perfekte cirkler med skarpe, mørke kanter og distraherer begyndere, som forveksler dem med strukturer; læg dækglasset på igen, langsomt og skråt. Små mørke prikker spredt på eller omkring cellerne er normalt almindelige mundbakterier, som skoleprotokoller såsom Ingrid Sciences fremgangsmåde for kindceller bemærker. De bekræfter, at der lever mikroorganismer i munden, hvilket eleverne måske vil huske, men de kan ikke artsbestemmes i denne øvelse og bør ikke tegnes som dele af cellen. Madrester og slimtråde farves uregelmæssigt og kraftigt; den indledende skylning skal reducere dem.

Hvad denne øvelse ikke kan gøre

Dette er en observation til undervisningsbrug, ikke en diagnostisk test. Intet ved cellernes udseende i en farvning i undervisningen kan diagnosticere infektion, kræft eller nogen anden sygdom, og artiklen bør ikke læses som en antydning af det modsatte. Præparatet viser form, grænse, cytoplasma og cellekerne ved to forstørrelser. Det viser ikke membranens ultrastruktur, organellernes detaljer eller molekylær identitet. Ved at angive begrænsningen tydeligt beskytter man både videnskaben og eleverne: Et godt resultat er en korrekt mærket tegning med angivelse af forstørrelse og farvestof, ikke en konklusion om helbred.

Elevark og mikroskopibilleder med markeringer

De to projektmaterialer til denne side er mikroskopibilledet med markeringer ovenfor og elevarket nedenfor. Udskriv ét elevark pr. elev, eller vis det på en projektor, og lad eleverne kopiere felterne til deres notesbøger.

Sådan bruges det i en undervisningsgang på 45 minutter: ti minutter til sikkerhedsgennemgang og prøvetagning, ti minutter til farvning og montering, femten minutter til observation og tegning ved begge forstørrelser og ti minutter til tjeklisten og sammenligning med mikroskopibilledet med markeringer. Tjeklistens punkter er bevidst helt konkrete. Tynd udstrygning, korrekt farvningstid, cellekerne mørkere end cytoplasma, forstørrelse noteret. En elev, der kan sætte kryds ved alle fire, har forstået det princip, undervisningen skal formidle: Mikroskoper viser forskelle, og farvninger skaber de forskelle, der er værd at vise.