Profion burum â glas methylen: cyfrif celloedd byw yn erbyn amseru resbiradaeth

Mae dau diwb ar y fainc. Mae'r ddau yn las. Mewn un, mae celloedd glas o dan y microsgop yn golygu burum marw. Yn y llall, mae tiwb sy'n troi o las i ddi-liw yn golygu bod y burum yn fyw ac yn resbiradu. Yr un llifyn, darlleniadau gwrthgyferbyniol. Cymysgwch y ddau brawf ac mae pob casgliad yn cael ei wrthdroi.

Y gwahaniaeth hwn yw holl bwynt yr erthygl. Llifyn rhydocs yw glas methylen: pan fydd wedi'i ocsidio mae'n las, a phan fydd wedi'i rydwytho mae'n las lewcomethylen di-liw. Mae cyfrif hyfywedd yn manteisio ar y cemeg hwn mewn cipolwg byr drwy ficrosgop. Mae arbrawf resbiradaeth yn manteisio arno mewn adwaith swmp wedi'i amseru. Mae angen ei brotocol ei hun, ei reolyddion ei hun, a'i amheuaeth ei hun ar bob un.

Y cyfrif hyfywedd: staenio byr, a darllen yn brydlon

Y protocol yn arddull bragdai yw'r fersiwn sydd wedi'i safoni fwyaf. Paratowch 0.01% w/v o las methylen mewn 2% o sitrad sodiwm, cymysgwch ef 1:1 â'r daliant burum, ac archwiliwch y cymysgedd ar ôl cyfnod byr sefydlog. Mae'r cyfnodau cyhoeddedig yn amrywio o 1 i 2 funud yn llawlyfr y Brewing Science Institute i tua 5 munud mewn protocolau ymchwil, gyda dull microbioleg gwin yr OIV yn gofyn am archwiliad o fewn 10 munud. Mae crynodiad y llifyn yn y cymysgedd cyfrif yn cyrraedd tua 0.005%. Llenwch siambr Neubauer well, ac ar chwyddhad o tua 400x dosbarthwch gelloedd glas tywyll yn anhyfyw a chelloedd heb eu staenio yn hyfyw. Mae celloedd glas golau yn cael eu cofnodi'n fyw yn null yr OIV, sydd eisoes yn awgrymu'r broblem o oddrychedd a drafodir isod.

Daw crynodiad y celloedd o geometreg y siambr. Pan gyfrifir y sgwâr canolog 1 mm cyfan, mae nifer y celloedd fesul mL yn hafal i N wedi'i luosi â'r ffactor gwanhau wedi'i luosi â 10^4, lle N yw'r cyfrif yn yr arwynebedd hwnnw, fel y nodir yn nulliau burum yr ASBC. Mae hyfywedd yn symlach: celloedd heb eu staenio wedi'u rhannu â chyfanswm y celloedd, wedi'i luosi â 100. Cyfrifwch tua 400 o gelloedd i amcangyfrif hyfywedd, gan ddilyn astudiaeth gymharu bragdai FEMS ac arfer yr OIV. Defnyddiwch un rheol ffin yn gyson, er enghraifft cynnwys celloedd ar linellau gwaelod a chwith y grid ac eithrio'r rhai ar y llinellau uchaf a dde.

Mae angen rheol ar gyfer blagur cyn dechrau cyfrif. Confensiwn cyffredin yw cyfrif blaguryn yn gell ar wahân unwaith y bydd yn cyrraedd tua hanner maint y famgell, a'i gyfrif gyda'r famgell os yw'n llai na hynny. Pa bynnag reol a ddewisir, defnyddiwch hi ym mhob sgwâr ac ysgrifennwch hi ar y daflen waith fel bod y person nesaf yn ei hailadrodd.

Taflen waith gyfrif (argraffwch hon)

Mae'r daflen waith hon yn adnodd gwreiddiol ar gyfer yr erthygl hon. Copïwch hi i lyfr nodiadau neu argraffwch un ar gyfer pob sampl.

Hyfywedd (%) = 100 x heb eu staenio / (heb eu staenio + glas tywyll). Cyfanswm y celloedd fesul mL = N x ffactor gwanhau x 10^4, gyda N o arwynebedd diffiniedig y siambr. Cofnodwch y cyfnod staenio wrth ymyl y canlyniad, oherwydd ni ellir atgynhyrchu rhif hyfywedd heb ei amseriad.

Pam mae rhifau hyfywedd yn newid

Amseriad yw'r ymyriad cyntaf, ac mae'n gweithio i'r ddau gyfeiriad. Mae celloedd sy'n weithredol yn fetabolig yn rhydwytho'r llifyn, felly gall darlleniad cynnar ddal celloedd byw cyn iddynt orffen ei rydwytho a'u camddosbarthu'n farw. Ond mae amlygiad hirfaith ynddo'i hun yn wenwynig ac yn creu celloedd glas sydd wedi'u difrodi mewn gwirionedd, gan gynhyrchu staenio sy'n awgrymu marwolaeth ar gam. Felly mae protocol addysgu labordy yn pennu cofnodi o fewn 5 munud, fel y dogfennir mewn protocol addysgu burum o Wisconsin. Y ffordd ddiogel o'i fynegi yw bod asesu â glas methylen yn dibynnu ar amser, felly pennwch un cyfnod byr a'i gadw'n gyson ar draws pob sampl mewn cyfres.

Mae ail duedd mewn samplau â hyfywedd isel. Mae'r dull safonedig yn rhybuddio y gall glas methylen oramcangyfrif gwir hyfywedd islaw tua 80%, oherwydd nid yw celloedd sy'n dal i rydwytho llifyn o reidrwydd yn cadw'r gallu i atgenhedlu. Mae llenyddiaeth bragu yn disgrifio'r un diffyg dibynadwyedd pan fydd hyfywedd wedi dirywio'n sylweddol. Triniwch las methylen fel amcangyfrif bras cyflym, a chadarnhewch benderfyniadau pwysig ynghylch hyfywedd isel, megis ailddefnyddio meithriniad i frechu bragu, â chyfrifiadau ar blatiau neu staen cyflenwol.

Effeithiau'r matrics sy'n dod yn drydydd. Mae dull yr OIV yn gweithio ger pH 4.6 ac yn rhybuddio bod samplau â pH isel sydd wedi'u byfferu'n gryf yn atal y llifyn rhag ymddwyn yn gywir, gan hefyd gynghori yn erbyn defnyddio'r prawf uwchlaw 100 g/L o siwgr, lle mae celloedd yn ymddangos yn las golau yn gamarweiniol. Canfu cymhariaeth arbrofol o pH staenio fod sensitifrwydd yn newid yn sylweddol ar draws yr ystod a brofwyd, yn gyson ag astudiaeth o ddull glas methylen sy'n dibynnu ar pH. Mae malurion yn fagl ar wahân: mae gronynnau wedi'u staenio mewn stwnshiau budr yn dynwared celloedd marw ac yn cynyddu'r amrywioldeb rhwng gweithredwyr.

Mae'r amrywioldeb hwn wedi'i feintioli, nid adroddiad anecdotaidd mohono. Mewn treial bragdai chwe mis a adroddwyd yn gymhariaeth burum FEMS, roedd gwyriad safonol mesuriadau glas methylen dyblyg yn 6.1% ar gyfartaledd o'i gymharu â 0.2% ar gyfer cytometreg llif ag oxonol, gyda dau weithredwr yn gwahaniaethu hyd at 13 pwynt canran ar yr un sampl. Canfu cymhariaeth feintiol o ddulliau hyfywedd yn 2023 fod microsgopeg fflworoleuedd a chytometreg llif yn sylweddol fwy manwl, gan ddangos hefyd fod perfformiad yn dibynnu ar y rhywogaeth a'r matrics. Mae'r disgrifiad clasurol o'r dull gan Painting a Kirsop (PMID 24430080) yn parhau'n bwynt cyfeirio, ac mae adolygiad ehangach o brofion hyfywedd a bywiogrwydd burum (PMID 25154541) yn gosod glas methylen ymhlith profion cyflenwol yn hytrach na rhai terfynol. Nid yw glas trypan yn welliant awtomatig yma: mae'n dangos colli cyfanrwydd y bilen, tra bo glas methylen yn dangos amsugno ynghyd â gweithgarwch rhydwytho, felly gall celloedd dan straen gael eu dosbarthu'n wahanol o dan y ddau lifyn.

Yr arbrawf resbiradaeth: amserwch ddiflaniad y glas

Nid yw'r ail brawf byth yn defnyddio microsgop. Mae burum ynghyd â glwcos a glas methylen gwanedig yn mynd i diwb caeedig, ac mae'r cloc yn mesur pa mor hir y mae'n ei gymryd i'r glas ddiflannu. Wrth i gelloedd fetaboleiddio, maent yn cynhyrchu cyfwerthoedd rhydwythol sy'n trosi'r llifyn glas i'w ffurf ddi-liw, tra bo ocsigen toddedig yn ei ailocsidio'n ôl. Unwaith y bydd y celloedd yn gostwng lefel yr ocsigen, rhydwythiad net sy'n ennill ac mae'r tiwb yn dadliwio. Felly mae'r pwynt terfyn yn adlewyrchu cydbwysedd resbiradaeth, crynodiad y llifyn, ac argaeledd ocsigen, a dylid ei adrodd fel amser rhydwytho neu ddadliwio glas methylen, nid fel cyfradd uniongyrchol defnyddio ocsigen moleciwlaidd.

Defnyddiwch lifyn llawer mwy gwanedig nag mewn gwaith hyfywedd fel bod yr amseriad mewn ystod gyfleus. Mae llawlyfr gwaith ymarferol gofynnol Safon Uwch AQA yn safoni hyn yn dda: 1 g o glwcos fesul 100 mL o ddŵr wedi'i gynhesu i tua 30 C, 5 g o furum sych wedi'i ychwanegu yn union cyn ei ddefnyddio, a llifyn gweithio o tua 0.001% wedi'i baratoi drwy wanhau 0.1 mL o stoc 1% i 100 mL. Cymysgwch 2 mL o ddaliant burum a glwcos â 2 mL o lifyn gweithio, gadewch iddo gyrraedd cydbwysedd ar dymheredd y prawf, ysgwydwch unwaith am 10 eiliad, dechreuwch yr amserydd, a pheidiwch ag ysgwyd eto. Mae ysgwyd yn ailgyflwyno ocsigen ac yn gwneud y tiwb yn las eto, a dyma'r arteffact gweithdrefnol mwyaf o bell ffordd. Mae AQA yn nodi y dylai'r paratoad fel arfer ddadliwio o fewn tua 5 munud ar 35 C, gyda chyfartaleddau treial o 275 s ar 20 C, 128 s ar 35 C, a 145 s ar 45 C. Enghreifftiau o un trefniant yw'r rhain, nid meincnodau cyffredinol. Cefnogir y cysylltiad meintiol rhwng cyfradd rhydwytho a burum sy'n weithredol yn fetabolig o dan amodau rheoledig gan astudiaethau rhydwytho penodol, gan gynnwys gwaith sydd wedi'i fynegeio fel PMID 25773544 a'r astudiaeth fecanistig yn Yeast (2014).

Arddangosiad dros amser (adnodd gwreiddiol)

Mae'r tabl isod yn arddangosiad gwreiddiol a gynhyrchwyd ar gyfer yr erthygl hon gan ddefnyddio'r trefniant yn arddull AQA a ddisgrifir uchod: 2 mL o gymysgedd burum a glwcos ynghyd â 2 mL o lifyn gweithio o tua 0.001%, un ysgwyd am 10 eiliad, yna deori heb darfu arno. Darlleniadau enghreifftiol yw'r cofnodion yn y fformat y dylai grŵp o fyfyrwyr ei gofnodi, gyda'r mynegai cyfradd wedi'i ddiffinio fel 1 wedi'i rannu â'r amser dadliwio mewn eiliadau. Cynhaliwch y prawf gyda'r un tiwbiau a disodlwch y cofnodion hyn â gwerthoedd wedi'u mesur.

Plotiwch y mynegai cyfradd yn erbyn tymheredd ar gyfer tiwbiau A, B, ac C. Mae'r gromlin yn codi ac yna'n gwastatáu neu'n gostwng, sef y patrwm disgwyliedig a ysgogir gan ensymau, nid llinell syth. Nid yw tiwbiau D, E, ac F yn bwyntiau data ar y gromlin honno. Nhw yw'r rheolyddion sy'n gwneud y gromlin yn ddehongladwy.

Rheolyddion sy'n rhoi ystyr i bob prawf

Mae angen tri phrawf ategol ar bob rhediad resbiradaeth. Dylai burum wedi'i ferwi neu ei ladd ynghyd â glwcos a llifyn aros yn las, gan brofi bod rhydwythiad cyflym yn dibynnu ar fetaboledd byw. Mae burum byw ynghyd â llifyn heb glwcos ychwanegol yn rheolydd swbstrad, ond disgwyliwch ddadliwio araf beth bynnag gan fod burum yn llosgi cronfeydd mewndarddol. Glwcos ynghyd â llifyn heb furum yw'r blanc cemegol, sy'n hanfodol oherwydd gall glwcos alcalïaidd rydwytho glas methylen heb unrhyw gelloedd yn bresennol.

Mae angen math gwahanol o reolaeth ar gyfrif hyfywedd: cysondeb gweithdrefnol. Yr un stoc llifyn, yr un gymhareb gymysgu, yr un cyfnod staenio, yr un arwynebedd siambr, yr un rheolau blagur a ffin, a chyfrif yn ddall lle bo modd. Pan fydd dau weithredwr yn anghytuno o ddeg pwynt, mae'r daflen waith fel arfer yn datgelu'r achos: amseriad gwahanol, trothwy glas gwahanol, neu reolau blagur gwahanol. Mae'r technegau ar gyfer paratoi ac edrych ar gelloedd wedi'u staenio yn cysylltu â dulliau staenio bacteriol syml, tra bo arolwg ehangach o'r hyn y mae'r llifyn yn ei farcio ar draws sbesimenau yn yr atlas staenio microsgopeg. Ar gyfer y ffiseg y tu ôl i ddarllen unrhyw ddwysedd glas yn feintiol, mae'r cyfeirnod amsugno sydd wedi'i labelu ag amodau yn esbonio pam mae'n rhaid i bob cyfernod ddod gyda'i amodau toddydd, pH, a chrynodiad.

Dewiswch y prawf yn ôl y cwestiwn. Mae faint o gelloedd sy'n fyw ar hyn o bryd yn gwestiwn cyfrif, sy'n cael ei ateb wrth y microsgop â thaflen waith. Mae pa mor weithredol y mae'r meithriniad hwn yn resbiradu yn gwestiwn cinetig, sy'n cael ei ateb â stopwats a thiwbiau rheoledig. Mae glas methylen yn gwasanaethu'r ddau, ond byth yn yr un tiwb ar yr un pryd.