Mesur rhywogaethau ocsigen adweithiol mewn arbrofion glas methylen

Mae dau labordy yn cynnal yr hyn y mae pob un yn ei alw'n arbrawf gwrthocsidiol glas methylen. Mae un yn adrodd bod y lliw yn atal rhywogaethau ocsigen adweithiol. Mae'r llall yn adrodd ei fod yn eu cynhyrchu. Mae'r ddau yn dangos cromliniau ymateb i ddos clir. Mae'r ddau yn ddidwyll. Nid twyll nac anghymhwysedd sy'n gyfrifol am y gwahaniaeth. Yn hytrach, mesurodd y ddau grŵp bethau gwahanol o dan olau gwahanol, gyda chwiliedyddion sy'n ateb cwestiynau gwahanol, ac yna disgrifiodd y ddau ateb â'r un gair: ROS.

Mae glas methylen yn foleciwl anodd ei fesur yn fanwl gywir oherwydd ei fod yn cymryd rhan yn y cemeg y mae i fod i'w arsylwi. Yn y tywyllwch mae'n cludo electronau rhwng rhoddwyr a derbynyddion ac yn dychwelyd i'w ffurf gychwynnol, yn barod i gylchredeg eto. O dan olau mae'n dod yn ffotosensiteiddiwr, gan gyrraedd cyflwr tripled cynhyrfol lle gall drosglwyddo egni i ocsigen i greu ocsigen sengled neu drosglwyddo electronau i greu radicalau a hydrogen perocsid. Gall unrhyw chwiliedydd a roddir yn y system honno gael ei ocsidio, ei rydwytho, ei gannu, neu ei guddio'n optegol gan y lliw ei hun. Felly, nid beth yw'r rhif yw cwestiwn cyntaf unrhyw ddarlleniad ROS byth. Y cwestiwn yw beth mae'r prawf yn ei ganfod mewn gwirionedd, a beth mae'r lliw yn ei wneud i'r prawf.

Amplex Red: prawf hydrogen perocsid wedi'i galibro

Y cyfuniad o las methylen ac Amplex Red yw'r paru mwyaf cadarn yn y llenyddiaeth hon, pan gaiff ei sefydlu'n gywir. Mae'r cemeg yn benodol: mae perocsidas rhuddygl poeth yn defnyddio hydrogen perocsid i ocsidio'r swbstrad Amplex i gynnyrch fflwroleuol, resorufin, mewn stoichiometreg sydd oddeutu un i un. Mae perocsid o'r sampl yn dod yn fflworoleuedd yn y synhwyrydd. Nid oes dim arall yn y teulu ROS confensiynol yn gyrru'r adwaith hwnnw'n uniongyrchol.

Y fantais bendant yw calibro. Mae ymchwilydd gofalus yn profi safonau perocsid hysbys yn yr un byffer, gyda'r un crynodiadau o berocsidas a swbstrad, yr un amser deori, a'r un gosodiadau optegol, ac yna'n darllen y samplau yn erbyn y gromlin honno. Yn yr astudiaeth o fitocondria ynysig o'r ymennydd sy'n sail i'r dull hwn, gwnaeth yr awduron hynny'n union, gan ychwanegu symiau hysbys o berocsid ar ddiwedd pob rhediad, ac adroddir y rhifau fel cyfraddau mewn picomolau y funud fesul miligram o brotein yn hytrach nag unedau fflworoleuedd mympwyol. Dyna sy'n troi llewyrch yn fesuriad.

Mae tri manylyn o'r astudiaeth honno yn werth eu hefelychu. Yn gyntaf, gwiriodd yr awduron y signal gyda chatalas, sy'n dinistrio perocsid. Daeth y cynnydd mewn fflworoleuedd a achoswyd gan las methylen i ben pan ychwanegwyd catalas, gan gadarnhau mai perocsid oedd y signal yn hytrach nag arteffact optegol. Yn ail, profwyd goleuo'n uniongyrchol drwy ddefnyddio caead ar y pelydryn cyffroi fel bod y samplau'n derbyn un wythfed o'r dos golau arferol, a dim ond naw y cant oedd y gostyngiad yn y signal. Roedd mwy na naw deg y cant o'r perocsid a adroddwyd ganddynt yn annibynnol ar y golau mesur. Yn drydydd, mesurwyd dileu perocsid ar wahân gydag electrod a chanfuwyd bod y lliw yn cynyddu'r cynhyrchu ac yn arafu'r clirio. Byddai chwiliedydd sy'n adrodd fflworoleuedd net yn unig wedi cymysgu'r ddwy effaith hynny.

Mae ffyrdd o hyd i'r prawf fethu, ac mae glas methylen yn datgelu nifer ohonynt. Mae'r lliw yn amsugno'n eang ar draws yr un rhanbarth coch lle mae resorufin yn allyrru, felly ar grynodiadau uchel o'r lliw gall y sampl guddio ei signal ei hun drwy effeithiau hidlydd mewnol. Dylai safonau felly gynnwys yr un crynodiad o'r lliw â'r samplau. Gall Amplex Red hefyd ffotoocsidio ar ei ben ei hun, a gall ei gynnyrch resorufin fynd i mewn i gylchredeg ffotorhydocs sy'n cynhyrchu uwchocsid a pherocsid, sy'n bwysig iawn pan fydd yr arbrawf hefyd yn goleuo ffotosensiteiddiwr. Yr ateb ymarferol yw arbelydru'r samplau glas methylen yn gyntaf a phrofi alicwotau gydag adweithyddion Amplex yn y tywyllwch, yn hytrach na goleuo'r lliw a'r chwiliedydd gyda'i gilydd. Yn olaf, nid atal signal Amplex yn unig y mae dismutas uwchocsid yn ei wneud: gall trosi uwchocsid yn berocsid ei gynyddu. Nid yw rheolydd SOD sy'n cynyddu fflworoleuedd wedi methu. Mae wedi adnabod uwchocsid fel rhywogaeth yn gynharach yn y llwybr.

DCFDA: dangosydd ocsidiad amhenodol

Y paru o las methylen a DCFDA yw ffynhonnell y rhan fwyaf o'r dryswch. Mae DCFH-DA yn rhagflaenydd ar gyfer llwytho celloedd. Mae esterasau y tu mewn i'r gell yn tynnu ei grwpiau asetad i adael DCFH anfflwroleuol, ac mae ocsidio DCFH yn cynhyrchu DCF fflwroleuol. Mae'r rhestr o bethau sy'n ei ocsidio yn hir: radicalau hydrocsyl, canolraddion perocsidas a haem, nitrogen deuocsid, asid hypocloraidd, a radicalau sy'n deillio o berocsinitrit. Nid yw hydrogen perocsid ar ei ben ei hun yn ei ocsidio'n uniongyrchol ar unrhyw gyfradd ddefnyddiol; yn gyffredinol, mae fflworoleuedd sy'n dibynnu ar berocsid angen haearn, proteinau haem, neu gemeg perocsidas yn y broses.

Daw'r feirniadaeth y dylai pob adran ddulliau ei dyfynnu o ddadansoddiad Kalyanaraman a'i gydweithwyr o DCFH fel chwiliedydd, fel y'i crynhoir yn yr astudiaeth o fitocondria'r ymennydd a wrthododd DCFDA am y rheswm hwn. Dangoswyd bod y lliw yn adweithio'n araf, gyda stoichiometreg heb ei nodweddu, heb galibro dilys, a chyda chyfansoddion nad ydynt yn ROS. Mae'r chwiliedydd hefyd yn chwyddo'r hyn y mae'n ei fesur: mae ocsidiad un electron o DCFH yn cynhyrchu radical DCF sy'n adweithio ag ocsigen i greu uwchocsid, sy'n dismutadu i berocsid ychwanegol. Mae'r darlleniad yn creu rhan o'r cemeg y mae'n ei adrodd.

Nid yw hyn yn gwneud DCFDA yn ddiwerth. Mae'n ei wneud yn brawf sgrinio, nid yn ddull adnabod. Mae cynnydd mewn fflworoleuedd DCF yn golygu bod ocsidiad y chwiliedydd sy'n dibynnu ar ocsidydd wedi cynyddu. Nid yw'n golygu bod perocsid wedi cynyddu, ac yn sicr nid yw'n golygu bod cyfanswm ROS wedi cynyddu, gan nad oes un chwiliedydd yn mesur y cyfanswm hwnnw. Adroddodd gwaith cynharach ar las methylen a oedd yn dibynnu ar ocsidiad DCF uwchlaw un micromolar effeithiau proocsidiol, tra bod systemau eraill yn yr un cyfnod yn adrodd amddiffyniad rhag marwolaeth celloedd a achoswyd gan berocsid. Gall y ddau arsylwad fod yn wir am yr un lliw mewn cyd-destunau rhydocs gwahanol, ac ni all canlyniad DCF ar ei ben ei hun ddweud pa ocsidydd oedd yn gyfrifol am y signal. Pwysigrwydd y gwaith cynharach ar fitocondria'r ymennydd yw iddo ddisodli'r prawf sgrinio hwn â mesuriad perocsid wedi'i galibro a chanfod y baich yn uniongyrchol: roedd hyd yn oed can nanomolar o'r lliw yn cynyddu rhyddhau perocsid sawl gwaith ar draws pob swbstrad a chyflwr resbiradol a brofwyd.

Mae un trap arall gyda DCFDA sy'n benodol i las methylen. Mae gan y lliw liw dwys ac mae'n weithredol o ran rhydocs, felly gall gannu fflworoleuedd, diffodd allyriad, neu ocsidio cemeg y chwiliedydd yn annibynnol ar ROS cellog. Nid addurn dewisol yw rheolydd di-gelloedd sy'n cynnwys lliw a chwiliedydd ond dim celloedd. Dyma'r arbrawf sy'n dweud wrthych a yw'r lliw yn rhyngweithio â'r chwiliedydd.

Trapio sbin a chymeriant ocsigen: hunaniaeth a fflwcs

Tra bod y chwiliedyddion fflwroleuol yn adrodd bod rhywbeth y gellir ei ocsidio wedi ymddangos, mae cyseiniant sbin electronau gyda thrapiau sbin yn adrodd rhywbeth agosach at beth ydoedd. Defnyddiodd yr astudiaeth glasurol o ffotocemeg glas methylen ESR i ganfod y radical ascorbad o liw, ascorbad a golau, ac yna dangosodd ffurfiant perocsid mewn arbrofion cymeriant ocsigen a ffurfiant radicalau hydrocsyl wedi'i gatalyddu gan haearn mewn rhediadau trapio sbin. Atebodd pob techneg y cwestiwn na allai'r lleill ei ateb: rhoddodd ESR hunaniaeth y radical, rhoddodd cymeriant ocsigen fflwcs yr adwaith yn annibynnol ar unrhyw chwiliedydd fflwroleuol, a dangosodd y cyfuniad fod llwybrau ocsigen sengled a radicalau ill dau yn gweithredu yn yr un system wedi'i goleuo.

Mae'r canlyniad hwnnw o 1984 yn dal i ddarllen fel label rhybudd. Gyda golau ac asiant rhydwytho yn bresennol, cynhyrchodd y lliw berocsid, a gyda haearn yn bresennol cynhyrchodd y system y radical hydrocsyl, y rhywogaeth fwyaf adweithiol yn y set. Cysylltodd yr awduron hyn ag ascorbad yn y llygad a chwestiynwyd defnydd offthalmig diofal. Dylai darllenwyr heddiw nodi'r amodau: golau ynghyd â rhydwythydd ynghyd â haearn. Tynnwch unrhyw un o'r rhain ac mae'r llwybr yn gwanhau neu'n diflannu.

Mae electrodau ocsigen yn ennill eu lle mewn ffordd wahanol. Mae electrod math Clark yn mesur defnydd net o ocsigen, sy'n sefydlu bod cemeg rhydocs a yrrir gan y lliw yn defnyddio ocsigen moleciwlaidd ac yn rhoi cineteg na all unrhyw arteffact fflworoleuedd ei ffugio. Nid yw'n adnabod y cynnyrch. Mae ffurfio perocsid, uwchocsid a dŵr, a dadfeiliad ocsigen sengled, i gyd yn defnyddio ocsigen. Mae fflwcs heb hunaniaeth yr un mor anghyflawn â hunaniaeth heb fflwcs, a dyna pam mae'r papurau cadarn yn paru'r electrod â phrawf perocsid wedi'i galibro neu drap.

Pam mae canlyniadau gwrthocsidiol yn gwrthdaro

Rhowch y tri darlleniad ochr yn ochr ac mae'r gwrthddywediadau ymddangosiadol yn y llenyddiaeth ar las methylen yn dod yn wahaniaethau mewn dull ynghyd â thair ffaith fiolegol.

Yn gyntaf, mae'r lliw yn gludydd electronau ac yn ffynhonnell perocsid. Drwy ddargyfeirio electronau oddi wrth y safleoedd resbiradol lle byddai ocsigen fel arall yn dod yn uwchocsid, gall leihau un ROS tra bod ei ffurf rydwythiedig yn rhydwytho ocsigen yn uniongyrchol i berocsid, gan gynyddu un arall. Dylai labordy sy'n ymdrin â chemeg rhydocs mitocondriaidd a'i rôl osgoi felly ddisgwyl atebion sy'n dibynnu ar y chwiliedydd: mae darlleniad sy'n sensitif i uwchocsid yn gostwng tra bod darlleniad perocsid yn codi yn yr un cwfed.

Yn ail, mae perocsid mewn dosau isel yn signal, nid yn ddifrod yn unig. Canfu'r astudiaeth o fitocondria ymennydd llygod a ddilynodd y gwaith cynharach gynhyrchu perocsid o gyn lleied â hanner cant nanomolar o'r lliw heb friwiau DNA mitocondriaidd ar lefelau therapiwtig, gydag amddiffyniad rhag briwiau a achoswyd gan rotenon ar ôl rhagdriniaeth. Dim ond ar gan micromolar, ymhell uwchlaw'r ystod therapiwtig, y difrododd y lliw ddarnau DNA penodol, a chynhyrchodd golau coch ynghyd ag ugain micromolar o'r lliw ocsigen sengled a ddifrododd yr holl ddarnau a brofwyd. Mae'r mecanwaith arfaethedig yn hormetig: mae cynhyrchu perocsid ysgafn yn sbarduno amddiffynfeydd gwrthocsidiol sy'n gysylltiedig â Nrf2 a biogenesis mitocondriaidd, felly mae darlleniad proocsidiol tymor byr yn rhagflaenu canlyniad gwrthocsidiol tymor hwy. Gall prawf a ddarllenir ar ôl un awr a phrawf a ddarllenir ar ôl un diwrnod anghytuno oherwydd bod y fioleg wedi newid rhyngddynt.

Yn drydydd, mae golau'n penderfynu pa foleciwl sydd hyd yn oed yn bresennol. Mae goleuo'n dadfethyleiddio'r lliw tuag at Azure B a chynhyrchion cysylltiedig, ac mae lamp y microsgop dros ddysgl yn ddigon i'w ffotosensiteiddio. Mae arbrofion yn y tywyllwch ac arbrofion wedi'u goleuo yn arbrofion gwahanol, a dylai adran rheolyddion goleuo a thrin y lliw unrhyw brotocol eu trin felly.

Set leiaf o reolyddion, a sut i ddarllen unrhyw honiad

Y gymhariaeth isod yw'r adnodd cyfeirio gwreiddiol ar gyfer yr erthygl hon. Cyn derbyn unrhyw ganlyniad ROS glas methylen, gwiriwch pa res a gwblhaodd yr awduron a pha un a hepgorwyd ganddynt.

Mae rheol ddarllen ymarferol yn dilyn. Mae Amplex gyda pherocsidas, wedi'i galibro, gyda gwiriad catalas, yn dystiolaeth am berocsid. Mae DCFDA yn dystiolaeth am ocsidiad amhenodol y chwiliedydd a dim byd mwy. Mae trapio sbin gyda rheolyddion sborionwyr yn dystiolaeth am hunaniaeth radicalau. Mae cymeriant ocsigen yn dystiolaeth am fflwcs. Mae brawddeg sy'n honni mwy nag y gall ei phrawf ei gefnogi, pa mor hyderus bynnag y'i hysgrifennwyd, yn frawddeg am y chwiliedydd, nid am y lliw. Mae trafodaethau cysylltiedig am ddibyniaeth ar ddos a'r ystod hormetig, llif electronau mitocondriaidd, ymyrraeth â phrofion mewn samplau wedi'u staenio, ac arteffactau goleuo mewn microsgopeg yn ymhelaethu ar bob un o'r pwyntiau hyn, ac mae pob un yn parhau'n ddilys ar ôl disodli ei gyfeirnod dalfan.