Glas methylen mewn ymchwil ar bysgod sebra: ychwanegyn hwsmonaeth a ffactor drysu arbrofol

Mae dŵr wyau pysgod sebra yn aml yn las golau, a phrin fod neb yn cofnodi pam. Glas methylen yw'r llifyn, a ychwanegir yn erbyn ffwng, ac mae'r rhan fwyaf o brotocolau yn ei drin fel elfen gefndirol. Nid cefndir yw'r cysyniad cywir yma. Cysyniad gwell yw ffactor arbrofol nas rhestrir: rhywbeth sy'n bresennol mewn dysglau sydd wedi'u trin ac yn absennol o reolyddion, sy'n weithredol yn ffarmacolegol ar y crynodiadau a ddefnyddir, ac sy'n gallu newid yr union bwyntiau terfyn y mae'r arbrawf yn eu mesur.

Mae'r gwahaniaeth hwnnw'n llywio popeth isod. Un cwestiwn yw hwsmonaeth wrthffyngaidd arferol. Cwestiwn gwahanol yw a yw'r ychwanegyn yn niwtral o ran eich prawf. Mae'r llenyddiaeth ddiweddar ar bysgod sebra yn cynnig ateb calonogol i'r cyntaf ac ateb anesmwyth i'r ail.

Beth mae'r canllawiau'n ei ragnodi mewn gwirionedd

Nid oes un safon gyffredin, ac mae hynny'n rhan o'r broblem. Mae canllawiau Cyngor Canada ar Ofal Anifeiliaid yn caniatáu 0.5 mg/L, neu 0.00005%, mewn hydoddiant cludo wyau a larfa i leihau twf ffwngaidd. Mae canllawiau Ewropeaidd ar anifeiliaid labordy yn disgrifio embryonau a gedwir mewn cyfrwng sy'n aml yn cynnwys yr un 0.00005%. Mae rysáit E3 Cold Spring Harbor yn nodi dwbl hynny, 1 mg/L neu 0.0001%, fel cynhwysyn yn y rysáit. Mewn cyferbyniad â hyn, ceir hepgoriad amlwg: mae canllaw prawf gwenwyndra embryonau pysgod yr OECD yn nodi dŵr gwanhau wedi'i ailgyfansoddi a chemegyn prawf, heb unrhyw argymhelliad ynghylch glas methylen naill ai yn ei fersiwn 2013 nac yn y diwygiad diweddarach. Felly mae un labordy'n magu embryonau pysgod sebra â glas methylen mewn dŵr glas o oriau cyntaf eu bywyd, mae un arall yn cynnal y prawf rheoleiddiol ar embryonau mewn dŵr clir, ac mae'r ddau'n galw eu cyfrwng yn arferol. Mae unrhyw un sy'n cymharu canlyniadau ar draws labordai, neu'n cyfuno rheolyddion hanesyddol, yn etifeddu'r anghysondeb hwnnw.

I roi'r crynodiadau mewn cyd-destun, mae 0.00005% tua 1.56 micromolar a 0.0001% tua 3.13 micromolar. Mae'r rhain yn niferoedd isel, ac mae'n demtasiwn eu dehongli fel rhai sy'n rhy isel i fod o bwys. Mae'r astudiaethau isod yn profi'r union dybiaeth honno, ar yr union grynodiadau hynny.

Mae darllenwyr sy'n dod o fyd cadw pysgod yn hytrach na'r labordy yn dod ar draws yr un moleciwl mewn cyd-destun gwahanol, a drafodir yn y canllaw acwariwm i las methylen. Mae'r cemeg yr un fath; mae'r drafodaeth am sut mae'r llifyn yn cludo electronau drwy gelloedd yn esbonio pam mae cyfansoddyn sy'n weithredol mewn adweithiau rhydocs yn ymddangos dro ar ôl tro mewn papurau ar fetabolaeth. Mae'r hyn sy'n dilyn yn benodol i ddŵr wyau pysgod sebra sy'n cynnwys glas methylen.

Metabolaeth: mae cyfeiriad yr effaith yn newid yn ôl y cam

Amlygodd yr astudiaeth fwyaf addysgiadol bysgod sebra a oedd yn datblygu'n arferol o ddiwrnod cyntaf eu bywyd hyd at 5 diwrnod ar ôl ffrwythloni, a mesurodd fetabolaeth ocsideiddiol ar bob cam, fel y mae'r adroddiad cyhoeddedig ar arbrofion metabolaeth embryonau yn ei ddisgrifio. Mae'n werth datgan y patrwm yn ofalus oherwydd ei fod yn gwrthdroi cyfeiriad.

Ar 1 diwrnod ar ôl ffrwythloni, cynyddodd y defnydd gwaelodol o ocsigen mewn embryonau a amlygwyd i'r ddau grynodiad hwsmonaeth. Ar 2 ddiwrnod, roedd potensial y bilen fitocondriaidd yn haen arwyneb y larfa yn uwch wrth ddod i gysylltiad â 0.00005%, 0.0001% a 0.0003%. Erbyn 4 i 5 diwrnod, ar ôl deor, roedd y cyfeiriad wedi gwrthdroi: gostyngodd y gwariant egni ocsideiddiol, boed yr amlygiad wedi bod yn barhaus ers ffrwythloni neu'n acíwt o ddiwrnod 3 i ddiwrnod 4 yn unig. Ochr yn ochr â hynny, gostyngodd trawsgrifiadau ar gyfer is-unedau cymhlygion resbiradol mitocondriaidd ar 1 a 4 diwrnod, ynghyd â thrawsgrifiadau sy'n gysylltiedig â steroidogenesis a glwconeogenesis.

Mae dau arsylwad pellach yn egluro'r darlun. Digwyddodd deor ychydig yn gynnar ar y crynodiad hwsmonaeth uwch, gyda'r embryonau a amlygwyd ar y blaen ar 2 ddiwrnod a'r rheolyddion wedi dal i fyny erbyn diwrnod 3. Ac roedd yr echelin straen ei hun yn ymddangos yn gyfan: pan roddwyd larfa 5 diwrnod oed dan straen drwy chwyrlïo, cododd cortisol y corff cyfan yn arferol yn y ddau grŵp. Felly nid yw'r llifyn yn wenwyn datblygiadol cyffredinol ar y dosau hyn, ac nid yw'n gwanhau pob ymateb ffisiolegol. Mae'n newid metabolaeth egni mewn ffordd sy'n dibynnu ar y cam datblygu, gan ei chynyddu cyn deor a'i lleihau wedyn.

Ymddygiad: pam mae dwy astudiaeth yn anghytuno, a pham y gall y ddwy fod yn gywir

Mae'r llenyddiaeth ar ymddygiad yn edrych yn wrthgyferbyniol nes bod dyluniadau'r amlygiad yn cael eu gosod ochr yn ochr. Amlygodd un astudiaeth o ddiogelwch datblygiadol ac ymddygiadol embryonau o tua 6 awr ar ôl ffrwythloni i grynodiadau hyd at 10 micromolar, gan adnewyddu'r hydoddiannau bob dydd hyd at ddiwrnod 4, yna symudodd y larfa i gyfrwng heb lifyn ar gyfer diwrnodau 5 a 6 a phrofi symudiad mewn prawf golau-tywyll ar ddiwrnod 6. Y canlyniad: dim effaith arwyddocaol ar farwolaeth, deor na morffoleg, a dim effaith y driniaeth ar symudiad. Yn rhesymol, argymhellodd yr awduron 10 micromolar fel terfyn uchaf o dan eu hamodau.

Cynhaliodd ail grŵp, yr oedd rhai o'i awduron hefyd yn awduron yr astudiaeth metabolaeth, yr amlygiad yn y ffordd y mae hwsmonaeth yn gweithio mewn gwirionedd: llifyn yn bresennol o 2 i 3 awr ar ôl ffrwythloni, gydag adnewyddu rhannol bob dydd, ac ymddygiad yn cael ei fesur tra oedd yr amlygiad yn parhau neu wedi digwydd yn ddiweddar. Ar yr un crynodiadau arferol, dangosodd y larfa lai o symudiad mewn prawf 24 awr, canlyniad y gellid ei ailadrodd ar draws straenau a labordai, ac olrheiniodd yr astudiaeth o ddrysu ymddygiadol yr effaith tuag at dôn serotonergig, yn gyson â gallu hysbys y llifyn i atal monoamin ocsidas. Yn fwyaf dadlennol, cuddiodd cyfrwng embryonau a oedd yn cynnwys glas methylen yr ymateb symud disgwyliedig i'r SSRI fluoxetine. Felly gall prawf sgrinio a gynhelir mewn dŵr glas fethu â chanfod effaith cyffur y byddai dŵr clir yn ei datgelu.

Nid oes gwrthddywediad gwirioneddol. Gall cyfansoddyn adael dim effaith weddilliol y gellir ei chanfod ddeuddydd ar ôl ei olchi allan mewn un prawf, a dal i fod yn weithredol tra bo'n bresennol mewn prawf arall. Y dehongliad ymarferol yw bod y canlyniad nwl yn cyfiawnhau terfyn crynodiad uchaf, nid honiad o niwtraliaeth, tra bo'r canlyniad cadarnhaol yn disgrifio'r risg sydd o bwys: amlygiad gweithredol yn ystod y cyfnod mesur, yn yr union drefniant y mae'r rhan fwyaf o labordai yn ei ddefnyddio.

Llifyn rhydocs y tu mewn i brawf rhydocs

Mae un fagl arall yn haeddu ei pharagraff ei hun oherwydd ei bod yn ystumio'r offeryn mesur yn hytrach na'r anifail. Mae prawf gwariant egni Alamar Blue ei hun yn gemeg rhydocs: resazurin yn cael ei rydwytho i resorufin fflworoleuol. Mae glas methylen hefyd yn gemeg rhydocs. Mewn rheolyddion heb gelloedd, gostyngodd y ddau grynodiad hwsmonaeth fflworoleuedd Alamar Blue ychydig ond yn arwyddocaol ar ôl 24 awr. Yn yr arbrofion ar anifeiliaid, golchwyd yr embryonau a amlygwyd o leiaf dair gwaith mewn cyfrwng heb lifyn cyn y prawf, ac roedd yr effaith fiolegol yn y larfa a oedd wedi deor yn fwy na'r ymyrraeth heb gelloedd. Felly mae'r ddau beth yn wir: mae anifeiliaid wedi'u golchi yn cario effaith fetabolaidd wirioneddol, ac mae llifyn heb ei olchi allan yn ychwanegu arteffact cemegol uniongyrchol ar ben hynny. Rhaid i reolyddion wahanu'r ddau, neu nid yw'r naill rif na'r llall yn golygu dim. Mae canllawiau cyffredinol ar ddehongli canlyniadau profion sy'n defnyddio llifynnau yn arbennig o berthnasol yma.

Llinell amser y camau datblygu

Yr adnodd gwreiddiol ar gyfer yr erthygl hon. Y crynodiadau yw'r ddau werth hwsmonaeth safonol, 0.00005% a 0.0001%, oni nodir yn wahanol.

Y patrwm i'w gofio yw cynnydd cynnar a gostyngiad diweddarach mewn pwyntiau terfyn metabolaidd, gydag effeithiau ymddygiadol yn bresennol yn ystod yr amlygiad ac yn anghanfyddadwy ar ôl clirio'r llifyn o'r corff yn yr un prawf a brofodd hynny.

Rhestr wirio ar gyfer dylunio rheolyddion

Yr ail adnodd gwreiddiol. Defnyddiwch ef pan fydd protocolau pysgod sebra sy'n defnyddio glas methylen yn cydblethu ag arbrawf.

1. Cofnodwch y llifyn fel adweithydd, nid fel dŵr. Nodwch y crynodiad fel canran ac mewn micromolar, amser dechrau a gorffen mewn oriau neu ddiwrnodau ar ôl ffrwythloni, yr amserlen adnewyddu, a'r cyfnod golchi allan cyn pob mesuriad.
2. Addaswch y rheolyddion i'r cwestiwn. Mae angen rheolyddion heb lifyn ar astudiaeth o'r cemegyn prawf; mae angen grwpiau heb lifyn a grwpiau â llifyn ar astudiaeth o hwsmonaeth, gan gofnodi'r canlyniad gwrthffyngaidd, gan nad oedd yr un o'r astudiaethau a ddyfynnwyd yn mesur effeithiolrwydd gwrthffyngaidd.
3. Golchwch cyn profion rhydocs, yna gwiriwch. Rinsiwch o leiaf dair gwaith mewn cyfrwng heb lifyn a chynhaliwch reolydd heb gelloedd sy'n cynnwys llifyn ac adweithydd ochr yn ochr, oherwydd bod y llifyn yn gostwng signal Alamar Blue yn uniongyrchol.
4. Ystyriwch ymddygiad a phwyntiau terfyn monoamin yn rhai risg uchel. Dylai astudiaethau o symudiad, ymateb dychryn, ymddygiad tebyg i orbryder, cyffuriau gwrthiselder ac atalyddion MAO osgoi'r llifyn wrth fesur neu ddangos niwtraliaeth sy'n benodol i'r pwynt terfyn; dileodd cyfnod golchi allan o un i ddau ddiwrnod un effaith ar symudiad, ond nid yw hynny wedi'i brofi ar gyfer paradeimau eraill.
5. Ystyriwch bwyntiau terfyn metabolaidd a mitocondriaidd yn rhai risg uchel ar bob cam. Mae defnydd o ocsigen, gwariant egni, potensial y bilen, a thrawsgrifiadau'r gadwyn resbiradol yn newid ar grynodiadau hwsmonaeth, i gyfeiriadau croes cyn ac ar ôl deor.
6. Peidiwch â throsglwyddo tybiaeth o niwtraliaeth rhwng dyluniadau. Nid yw canlyniad nwl ar ôl golchi allan yn berthnasol i amlygiad parhaus; nid yw canlyniad morffolegol nwl yn berthnasol i fetabolaeth na rhyngweithiad â chyffuriau; nid yw canlyniad mewn un straen, ar un tymheredd neu dros un hyd prawf yn berthnasol i rai eraill.
7. Nodwch y canllaw a ddilynwyd gennych a'i ddewis amgen. Enwch grynodiadau CCAC, y canllawiau Ewropeaidd neu Cold Spring Harbor yn benodol, a nodwch ble mae prawf embryonau'r OECD yn hepgor y llifyn, fel y gall darllenydd ddeall cyd-destun eich anifeiliaid.

Nid yw hyn yn dadlau yn erbyn defnyddio'r llifyn i gadw wyau'n fyw. Mae'n dadlau yn erbyn gadael i ddewis hwsmonaeth ddylanwadu ar y data heb ei archwilio. Moleciwl â ffarmacoleg yw'r glas yn y ddysgl, a'r arbrofion sydd fwyaf tebygol o gael eu hystumio yw'r union brofion sgrinio metabolaidd a niwroymddygiadol trwybwn uchel y mae pysgod sebra ifanc bellach yn cael eu ffafrio ar eu cyfer. Cofnodwch ef, rheolwch ef, golchwch ef allan cyn mesur, a gwiriwch y prawf y gallai fod yn cymryd rhan ynddo'n dawel.