Glas methylen ar gyfer staenio DNA ac RNA: cymwysiadau mewn geliau ac ar bilenni

Mae myfyriwr yn rhedeg gel agarose, yn ei staenio â glas methylen, ac yn gweld dim lle'r oedd disgwyl band llachar. Yn y bae nesaf, mae ymchwilydd ôl-ddoethurol yn staenio pilen Northern â'r un botel las ac yn cael bandiau ribosomaidd clir mewn tair munud. Mae'r myfyriwr yn dod i'r casgliad bod y gel wedi methu. Ni fethodd y gel. Roedd y ddwy dasg yn wahanol, ac mae'r un llifyn yn eu hateb â sensitifrwydd gwahanol, cefndir gwahanol, a rheolau gwahanol ar gyfer yr hyn sy'n digwydd nesaf.

Mae staen DNA glas methylen a staenio RNA â glas methylen yn rhannu'r un gemeg ond nid yr un diben. Mewn gel, mae'r llifyn yn dangos faint o asid niwclëig sydd mewn matrics mandyllog. Ar bilen, mae'n dangos a weithiodd y trosglwyddiad ac a lwythwyd y lonydd yn gyfartal. Unwaith y bydd y gwahaniaeth hwnnw'n glir, mae'r protocolau, y terfynau canfod, a'r terfynau cydnawsedd yn gwneud synnwyr.

Yr ateb byr

Llifyn cationig planar yw glas methylen sy'n rhwymo i asidau niwclëig yn anghofalent ac yn gildroadwy, drwy gyfuniad o atyniad electrostatig at ffosffad, rhyngosod rhwng parau basau, a chysylltu â'r rhigol fach. Y gallu i wrthdroi'r rhwymo yw'r pwynt. Gellir staenio bandiau a'u gweld dan olau gweladwy, eu dogfennu, ac yna eu dadstaenio neu eu glanhau ar gyfer clonio, hybrideiddio, neu ailbrobio.

Ar gyfer staenio DNA llinyn dwbl mewn gel agarose â glas methylen, y rysáit gyflym safonol yw 0.02 y cant w/v (200 microgram fesul mL) mewn dŵr, tua 15 munud o staenio a thua 15 munud o ddadstaenio â dŵr, gan edrych ar flwch golau gwyn. Ar gyfer pilenni, rysáit glasurol blot Northern yw 0.02 i 0.04 y cant o lifyn mewn asetad sodiwm ger pH 5.2, sawl munud o staenio ar ôl trosglwyddo a llonyddu, ac yna rinsio â dŵr a dadstaenio'n llwyr cyn hybrideiddio. Mae'r sensitifrwydd yn gymedrol: degau i gannoedd o nanogramau fesul band gel dan amodau da, ac mae canllawiau ceidwadol yn nodi 0.5 i 1 microgram. Mae hynny sawl trefn maint yn uwch na staeniau bromid ethidiwm a SYBR. Ar bilenni nid oes un terfyn canfod defnyddiol ar gyfer trawsgrifiad unigol, oherwydd mae'r staen yn dangos yn bennaf RNA ribosomaidd toreithiog a chyfanswm y deunydd a lwythwyd. Peidiwch â defnyddio hydoddiant atodiad manwerthu yn lle'r llifyn yn y naill rysáit na'r llall. Mae dulliau wedi'u dilysu yn rhagdybio llifyn gradd ddadansoddol, byfferau wedi'u diffinio, a thrin heb RNase pan fo RNA dan sylw.

Sut mae rhwymo'n gweithio, a lle mae'n camarwain

Mae tair rhan i'r model defnyddiol. Yn gyntaf, mae'r system gylchoedd â gwefr bositif yn cael ei denu at y sgerbwd ffosffad â gwefr negatif. Mae gwaith sbectrosgopig yn canfod mai'r elfen electrostatig hon sy'n dominyddu pan fo crynodiad yr halen yn isel, tra bo modelu a dynameg foleciwlaidd yn dangos bod rhyngosod a rhwymo yn y rhigol fach yn foddau sefydlog ar gyfer DNA llinyn dwbl, fel y crynhoir mewn astudiaeth sbectrosgopig o rwymo glas methylen i DNA. Yn ail, mae rhywfaint o ffafriaeth at GC, gyda modelu'n ffafrio camau CpG a GpC ac arbrofion yn adrodd cysylltu ffafriol â dwplecsau cyfoethog mewn GC mewn gwaith ar ffafriaethau rhyngosod glas methylen, ond mae dwplecsau AT hefyd yn rhwymo. Nid yw staenio arferol yn benodol i ddilyniant. Yn drydydd, mae DNA llinyn sengl ac RNA yn rhwymo'n bennaf drwy electrostateg a phentyrru â basau hygyrch a rhanbarthau dwplecs, a dyna pam mae cryfder y staenio'n amrywio yn ôl hyd, dilyniant, a strwythur eilaidd.

Mae dau ganlyniad i hyn. Gan fod y rhwymo'n anghofalent, mae'r llifyn yn golchi allan. Mae bandiau polyacrylamid yn pylu'n gyflym oni chânt eu sefydlogi'n fwriadol, ac mae amrywiad penodol ar gyfer sefydlogi parhaol yn bodoli yn union oherwydd bod staenio arferol yn dros dro, fel y disgrifir gan Soto a Draper ar gyfer geliau PAGE. Gan fod y llifyn yn ffotosensiteiddiwr, gall goleuo DNA wedi'i staenio am amser hir â golau llachar ym mhresenoldeb ocsigen ocsidio gwanin ac yn y pen draw achosi toriadau mewn llinynnau, mecanwaith a fanylir mewn gwaith ar ocsidio gwanin wedi'i sensiteiddio gan las methylen. Mae edrych yn fyr dan olau gwyn yn osgoi'r difrod UV adnabyddus sy'n gysylltiedig â llifoedd gwaith bromid ethidiwm clasurol, ac mae hynny'n fantais wirioneddol wrth adfer deunydd at ddefnydd paratoadol. Mae golau gweladwy yn fwy tyner, nid yn ddiniwed. Cadwch y goleuo'n fyr pan fydd y DNA yn cael ei glonio. Am y ffotocemeg ehangach y tu ôl i'r rhybudd hwnnw, gweler y ddau lwybr yn ffotocemeg glas methylen. Am y pâr rhydocs a'r cyflyrau gwefr sy'n egluro pam mae'r ffurf ocsidiedig yn rhwymo a'r ffurf rydwythiedig yn peidio, gweler cemeg strwythur a phriodweddau glas methylen.

Tasg un: staenio y tu mewn i geliau

Mae staenio gel yn ateb un cwestiwn: a oes digon o asid niwclëig yn y band hwn i'w weld â'r llygad. DNA llinyn dwbl mewn agarose yw'r achos sydd wedi'i nodweddu orau. Dilysodd dull gel glas methylen gwreiddiol Flores a'i gydweithwyr y protocol cyflym 0.02 y cant ar agarose 1 y cant a dangosodd adfer a chlonio llwyddiannus wedyn. Mae'r un protocol cyflenwr yn ymddangos ar dudalen cynnyrch glas methylen IBI Scientific, sy'n rhestru rysáit pilenni 0.04 y cant a'r amrywiad gel cyflym ochr yn ochr.

Llif gwaith ymarferol:

1. Rhedwch y gel fel arfer. Staeniwch ar ôl electrofforesis, nid yn ystod y broses, oni bai bod trosglwyddo neu gydraniad wedi'u dilysu ar gyfer dull wedi'i addasu.
2. Trochwch mewn glas methylen 0.02 y cant w/v mewn dŵr distyll, gan ei ysgwyd yn dyner, am tua 15 munud.
3. Dadstaeniwch drwy newid y dŵr sawl gwaith, am tua 15 munud i gyd, nes bod lliw cefndir y matrics yn lleihau a'r bandiau'n sefyll allan.
4. Tynnwch ffotograff yn ddi-oed ar ddyfais goleuo golau gwyn.

Mae agarose a pholyacrylamid yn ymddwyn yn wahanol. Mae agarose yn cadw llifyn yn y matrics, felly dadstaenio yw'r cam araf. Mae geliau polyacrylamid tenau yn staenio'n gyflym ond hefyd yn colli llifyn yn gyflym, sy'n helpu wrth dorri bandiau allan at ddibenion paratoadol ond sy'n amharu ar gofnodion archifol. Gellir lleoli oligonwcleotidau synthetig mewn polyacrylamid â'r un rysáit 0.02 y cant mewn 20 i 30 munud drwy olchi dro ar ôl tro â dŵr, gan ddilyn dulliau PAGE sefydledig yn arddull Current Protocols. Mae amrywiadau gwan iawn ger 0.0002 y cant mewn TBE gwan wedi'u hadrodd ar gyfer oligonwcleotidau paratoadol dros sawl awr, ond mae'r sylfaen dystiolaeth yn wannach.

Mae'r gwahaniaeth rhwng DNA ac RNA yn bwysig. DNA llinyn dwbl sy'n rhoi'r rhwymo strwythuredig cryfaf. Mae RNA a DNA llinyn sengl yn staenio, ond yn wannach ac yn llai rhagweladwy. Ar gyfer geliau RNA agarose â fformaldehyd, mae'r rhan fwyaf o labordai'n hepgor staenio glas yn y gel ac yn symud yr RNA i bilen yn gyntaf, yna'n ei staenio yno. Mae'r newid hwnnw'n cyfnewid signal gel gwan am signal pilen cliriach ynghyd â chofnod llwytho.

Tasg dau: staenio ar bilenni

Mae staenio pilenni yn ateb cwestiwn gwahanol: a weithiodd y trosglwyddiad, ac a oes modd cymharu'r lonydd. Y cymhwysiad clasurol yw staen blot Northern gildroadwy Herrin a Schmidt, a oedd yn wreiddiol yn defnyddio llifyn 0.04 y cant mewn asetad sodiwm 50 mM ar pH 5.0 am 2 i 3 munud gyda rins dŵr, y gellir ei dynnu â SDS gwan mewn SSPE cyn hybrideiddio.

Dyma'r amrywiad modern a ddefnyddir yn helaeth:

1. Trosglwyddwch RNA neu DNA dadnatureiddiedig i neilon neu nitrocellwlos, yna llonyddu drwy groesgysylltu UV neu bobi fel na chollir y sampl yn ystod staenio.
2. Dewisol ond cyffredin: gwlychwch y bilen mewn asid asetig 5 y cant am tua 15 munud.
3. Staeniwch am 5 i 10 munud mewn glas methylen 0.02 i 0.04 y cant mewn asetad sodiwm 0.3 i 0.5 M ger pH 5.2.
4. Rinsiwch a dadstaeniwch mewn dŵr am 5 i 15 munud, dogfennwch, yna tynnwch y llifyn gweddilliol cyn hybrideiddio.

Neilon â gwefr bositif sy'n dominyddu gwaith Northern. Mae nitrocellwlos hefyd yn gweithio gyda'r un llif gwaith asid asetig ac asetad. Defnyddir y ddelwedd i gadarnhau trosglwyddo, i gymharu bandiau 28S a 18S (neu 23S a 16S ar gyfer RNA bacteriol), i farcio ysgolion a safonau, ac i gadw cofnod bras ar gyfer normaleiddio cyfanswm yr RNA. Mae dulliau Northern cyhoeddedig yn meintioli bandiau ribosomaidd wedi'u staenio i wirio llwytho, gan gynnwys gwaith gwyddor llaeth a ddefnyddiodd bandiau ribosomaidd glas methylen ar gyfer normaleiddio. Gellir delweddu pilenni Southern yn yr un ffordd, ond mae'r llifyn wedi hen ennill ei le yn llawer mwy fel prawf llwytho a throsglwyddo Northern, ac mae DNA Southern yn cael ei ddadnatureiddio cyn trosglwyddo, felly nid yw ffigurau sensitifrwydd gel yn berthnasol.

Terfynau canfod a chefndir: lle mae'r glas ar ei golled

Mae'r gymhariaeth isod yn fras yn fwriadol. Mae perfformiad y staen yn dibynnu ar ganran y gel, lled y band, yr opteg, a gofal wrth ddadstaenio. Triniwch bob rhif fel trefn maint, nid fel manyleb.

Rheoli'r cefndir sy'n penderfynu a oes modd defnyddio'r signal cymedrol. Mae llifyn rhydd yn lliwgar iawn, felly daw'r cyferbyniad o dynnu llifyn heb ei rwymo heb dynnu'r llifyn sydd wedi rhwymo. Anaml y mae staen mwy crynodedig yn ychwanegu sensitifrwydd. Yn bennaf, mae'n ychwanegu amser dadstaenio. Rhedwch gyfres wanhau ar yr union gel, pilen, a chamera, a defnyddiwch dim ond yr ystod lle mae dwysedd integredig yn parhau'n gymesur â'r mewnbwn. Mae glas methylen yn cefnogi normaleiddio llwytho lled-feintiol. Nid yw'n brawf meintiol ag ystod ddeinamig eang oherwydd bod cynhwysedd y bilen, effeithlonrwydd trosglwyddo, dirlawnder, a dadstaenio'n amrywio o lôn i lôn.

Terfynau cydnawsedd: beth sy'n goroesi staenio

Mae clonio ar ôl staenio glas wedi'i ddangos. Torrodd Flores a'i gydweithwyr fandiau agarose wedi'u staenio allan, adfer y DNA, a'i ligadu a'i ddefnyddio ar gyfer trawsnewid, gan adrodd clonio gwell nag ar ôl bromid ethidiwm gydag UV. Y rheswm tebygol yw llai o ffotoddifrod, nid budd o'r llifyn ei hun. Cadwch yr amlygiad i olau gwyn yn fyr a glanhewch y DNA a adferwyd drwy broses arferol o echdynnu o gel.

Mae'r dystiolaeth ar gyfer PCR a dilyniannu yn fwy cyfyngedig. Mae llifyn gweddilliol yn rhwymo i asidau niwclëig, felly dadstaeniwch a glanhewch cyn camau ensymatig. Disgwylir i DNA wedi'i buro'n briodol o gel glas weithio, ond nid yw goddefgarwch i gario llifyn drosodd yn uniongyrchol wedi'i feintioli'n dda ar draws polymerasau a chemegau dilyniannu. Peidiwch â'i ragdybio.

Mae hybrideiddio blot yn gydnaws pan ddilynir y drefn yn gaeth: trosglwyddo, llonyddu, staenio, dogfennu, dadstaenio, hybrideiddio. Y dilyniant hwnnw yw cynllun Herrin a Schmidt. Mae staenio cyn trosglwyddo, neu hepgor dadstaenio, yn ddull gwahanol ac mae angen ei ddilysu ar wahân. Ar ôl tynnu'r llifyn, mae tynnu stilwyr ac ailbrobio safonol yn mynd rhagddynt fel arfer. Ar gyfer staenio ar lefel celloedd â'r un teulu o lifynnau, a pham nad yw rhesymeg ffilm sefydlog yn berthnasol i ddulliau celloedd byw, gweler yr atlas staenio microsgopeg.

Mae torri bandiau allan yn gweithio ar gyfer agarose paratoadol ac ar gyfer oligonwcleotidau PAGE a leolir â glas, ar yr amod bod yr amrywiad sefydlogi parhaol yn cael ei osgoi. Mae electroeliwio ar ôl dadstaenio yn gredadwy'n gemegol ar gyfer sylwedd sy'n rhwymo'n gildroadwy, ond prin yw'r data rheoledig ar gynnyrch sy'n benodol i las methylen. Tynnwch yr halen neu waddodwch ar ôl eliwio.

Methiannau sy'n ailadrodd

Fel arfer, mae bandiau gel gwan yn golygu bod y màs yn rhy fach ar gyfer staen lliwfetrig, yn enwedig ar gyfer targedau llinyn sengl byr neu RNA. Llwythwch fwy, defnyddiwch staen ffres, estynnwch yr amser staenio cyn cynyddu'r crynodiad, a stopiwch ddadstaenio'n gynharach. Mae gel glas unffurf heb gyferbyniad fel arfer yn golygu gorstaenio neu newid y dŵr yn rhy anaml. Mae bandiau PAGE yn pylu oherwydd y gemeg ddisgwyliedig, nid oherwydd staen sydd wedi methu. Tynnwch ffotograff yn gyflym. Mae cefndir pilen anwastad yn awgrymu plygiadau, swigod, olion bysedd, ysgwyd anwastad, neu drosglwyddo anghyson. Peidiwch â dehongli hynny fel llwytho anghyfartal heb reolydd hybrideiddio. Gall patrwm ribosomaidd gwan a thaenedig olygu diraddio, ond hefyd drosglwyddo anghyflawn, rhy ychydig o gyfanswm RNA (mae lonydd nodweddiadol yn cynnwys sawl microgram i ddegau o ficrogramau), neu ddadstaenio gormodol. Mae'r llifyn yn dangos RNA ribosomaidd toreithiog. Nid yw'n dangos trawsgrifiad penodol. Gwaith y stiliwr yw hynny.

Diogelwch a thrin heb orliwio

Mae glas methylen yn symlach i'w drin na bromid ethidiwm, ond nid yw'n ddiniwed. Mae taflen ddata diogelwch gyfredol MilliporeSigma yn dosbarthu'r llifyn fel gwenwyndra acíwt drwy'r geg Categori 4, yn niweidiol os caiff ei lyncu, gyda gwaredu drwy lwybr gwastraff cymeradwy yn unol â SDS glas methylen Sigma-Aldrich. Mae rhybuddion genowenwyndra cryfach yn perthyn i bromid ethidiwm, gan gynnwys effeithiau a amheuir ar gelloedd germ yn ei SDS bromid ethidiwm Sigma-Aldrich, ac mae ei geliau a'i hydoddiannau'n cael eu gwahanu'n gyffredin fel gwastraff cemegol peryglus, fel y nodir yng nghanllaw Thermo Fisher i staeniau asidau niwclëig. Dilynwch yr SDS a rheolau'r sefydliad ar gyfer y ddau. Cadwch lifyn sych wedi'i gau'n dynn ac yn sych, ailddefnyddiwch staen gweithio dim ond fel y mae'r protocol yn caniatáu, storiwch bilenni wedi'u staenio'n sych rhwng dalennau hidlo, a thynnwch ffotograffau o geliau cyn i'r bandiau wasgaru drwy drylediad.

Cofiwch y frawddeg ar gyfer y fainc labordy. Mae geliau'n profi gwelededd ar lwyth uchel dan olau gwyn. Mae pilenni'n profi trosglwyddo a llwytho cyn i'r stiliwr wneud y gwaith sensitif. Mae un llifyn yn gwasanaethu'r ddau, gyda sensitifrwydd cymedrol, rhwymo gildroadwy, a threfn weithrediadau gaeth.