Glas methylen mewn profion labordy G6PD: beth mae'r llifyn yn ei wneud mewn gwirionedd

Mae myfyriwr yn arsylwi dau diwb ar ôl eu deori. Mae un wedi troi i'r lliw disgwyliedig. Nid yw'r llall wedi gwneud hynny. Mae'r myfyriwr yn dod i'r casgliad bod gan yr ail glaf ddiffyg glwcos-6-ffosffad dehydrogenas. Gall y casgliad hwnnw fod yn gywir, ond mae'r rhesymu'n hepgor y cysyniad sy'n gwneud i'r prawf weithio. Nid oes dim yn y tiwb yn mesur yr ensym yn uniongyrchol. Mae'r tiwb yn mesur yr hyn y mae'r ensym yn ei gynhyrchu, gan ddefnyddio glas methylen fel cyfryngwr.

Unwaith y bydd y dull anuniongyrchol hwn yn glir, nid yw'r weithdrefn, y rheolyddion na'r rhestr hir o ganlyniadau anghywir yn ymddangos yn fympwyol mwyach.

Yr ateb byr

Dangosydd rhydocs yw glas methylen mewn profion G6PD. Mae'r ensym G6PD yn cynhyrchu NADPH, ac mae systemau sy'n dibynnu ar NADPH yn rhydwytho glas methylen o'i ffurf las i'w ffurf lewco ddi-liw (neu'n ei ddefnyddio i gludo electronau). Mae gweithgarwch ensym arferol yn arwain at rydwytho effeithlon. Mae gweithgarwch diffygiol yn arwain at rydwytho araf neu anghyflawn. Dyna'r signal cyfan.

Mae dau ddull hanesyddol yn defnyddio'r un llifyn ond mae eu pwyntiau terfyn yn wahanol. Cadwch y ddau ar wahân a bydd y rhan fwyaf o'r dryswch yn diflannu.

Dau brawf, un llifyn, pwyntiau terfyn gwahanol

Y cyntaf yw'r prawf rhydwytho glas methylen uniongyrchol, a ddisgrifiwyd gan Sass a'i gydweithwyr ac a werthuswyd yn ddiweddarach gan Gibbs. Yma, y llifyn ei hun yw'r pwynt terfyn: mae glas methylen glas wedi'i ocsidio yn cael ei rydwytho tuag at lewcomethylen glas di-liw, ac mae cyflymder y newid hwnnw'n adlewyrchu'r gallu i gynhyrchu NADPH. Mae'r papur sgrinio gwreiddiol wedi'i fynegeio ar PubMed o dan Sass et al. (1966).

Yr ail yw prawf rhydwytho methaemoglobin Brewer. Mae sodiwm nitraid yn ocsidio haemoglobin yn gyntaf i fethaemoglobin brown. Yna mae glas methylen yn gweithredu fel cyfryngwr trosglwyddo electronau: mae glas methylen wedi'i rydwytho yn trosglwyddo cyfwerthoedd rhydwytho i fethaemoglobin, gan ei droi'n ôl yn haemoglobin coch. Felly brown yn erbyn coch yw'r pwynt terfyn gweladwy, nid glas yn erbyn di-liw. Ymddangosodd y dull gwreiddiol yn Bwletin Sefydliad Iechyd y Byd (Brewer et al., 1960).

Mae galw'r assay Brewer yn brawf dadliwio llifyn yn anghywir o safbwynt cemegol. Mae'r llifyn yn cylchredeg; haemoglobin sy'n newid lliw. Mae'r diagram isod yn olrhain y ddau lwybr.

Yr adwaith sylfaenol

Mae G6PD yn catalyddu cam ocsideiddiol cyntaf y llwybr pentos ffosffad:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Mae celloedd coch aeddfed yn dibynnu'n helaeth ar y llwybr hwn am NADPH, fel yr adolygwyd yn Blood gan Luzzatto a'i gydweithwyr (2020). Mae NADPH yn cadw glwtathion yn ei ffurf rydwythiedig ac yn amddiffyn y gell rhag niwed ocsideiddiol. Mae glas methylen yn ymuno â'r system hon fel derbynnydd electronau. Mae digon o G6PD yn darparu digon o NADPH, sy'n galluogi rhydwytho effeithlon. Mae lefel isel o G6PD yn torri'r gadwyn wrth ei dolen gyntaf.

Meddyliwch am y llifyn fel mesurydd tanwydd, nid yr injan. Mae'n rhoi gwybodaeth am y cyflenwad NADPH. Gall unrhyw beth arall sy'n newid y cyflenwad hwnnw, neu'r darlleniad, symud y nodwydd heb unrhyw newid yn y genyn.

Sut mae'r weithdrefn o fath Brewer yn gweithio

Mae ryseitiau adweithyddion wedi amrywio dros y degawdau, felly ni ddylid camgymryd disgrifiad addysgol am brotocol clinigol. Mae pob labordy'n dilyn ei weithdrefn weithredu safonol ddilysedig ei hun. Gan gadw'r rhybudd hwnnw mewn cof, mae'r trefniant tiwbiau clasurol yn gweithio fel a ganlyn, mewn ffurf a ddogfennwyd gyda thri thiwb a deori am 3 awr yn y gweithrediad cyhoeddedig hwn:

1. Tiwb y claf: gwaed cyfan ynghyd â glwcos, sodiwm nitraid a glas methylen. Mae nitraid yn creu methaemoglobin, mae glwcos yn cynnal metaboledd y celloedd coch, ac mae'r llifyn yn darparu'r cludwr sy'n dibynnu ar NADPH.
2. Rheolydd wedi'i ocsidio: gwaed ynghyd â nitraid a glwcos ond heb las methylen. Mae'n dangos y pwynt terfyn methaemoglobin brown, sef y patrwm diffygiol.
3. Rheolydd haemoglobin: gwaed ynghyd â dŵr. Mae'n dangos y pwynt terfyn haemoglobin coch, sef y patrwm arferol.
4. Deorwch bob tiwb ar dymheredd agos at 37 C, fel arfer am 3 awr, gan gymysgu'n ysgafn.
5. Gwanhewch ddogn bach o bob tiwb mewn dŵr distyll i chwalu'r celloedd a gwneud y gymhariaeth lliw yn glir.
6. Cymharwch diwb y claf â'r ddau reolydd. Mae dychwelyd tuag at goch yn dangos gallu rhydwytho sylweddol. Mae parhau'n agos at frown yn awgrymu diffyg amlwg.

Defnyddiodd un fformiwleiddiad hanesyddol tua 1 mL o waed gydag adweithyddion ar grynodiadau yn agos at 180 mM o sodiwm nitraid, 280 mM o ddextros a 0.4 mM o las methylen. Ystyriwch y rhifau hynny'n enghraifft o'r llenyddiaeth, nid yn fanyleb gyffredinol.

Darllen y canlyniad

Mae prawf sgrinio ansoddol yn gwahaniaethu orau ar tua 30 i 40 y cant o weithgarwch arferol, fel y trafodir yn yr adolygiad hwn yn Malaria Journal o fylchau mewn canfod G6PD. Felly mae canlyniad sgrinio arferol yn golygu nad oedd yr assay wedi canfod diffyg difrifol. Nid yw'n cadarnhau bod y gweithgarwch yn gwbl arferol.

Pam mae sgrinio'n camarwain

Reticwlocytosis ar ôl haemolysis yw'r enghraifft glasurol o ganlyniad ffug arferol. Mae celloedd coch ifanc a reticwlocytau yn cynnwys mwy o G6PD na hen gelloedd. Yn ystod episod haemolytig acíwt, gall y celloedd hynaf, sydd â'r diffyg mwyaf, fod wedi'u dinistrio eisoes, gan adael poblogaeth ifanc y mae ei gweithgarwch yn ymddangos yn arferol mewn prawf. Mae'r un fioleg yn camarwain profion meintiol, nid dim ond profion sgrinio â llifyn.

Mae trallwysiad diweddar yn cuddio diffyg oherwydd bod celloedd coch y rhoddwr yn cyfrannu eu hensym eu hunain at y sampl. Mae Mayo Clinic Laboratories yn rhestru trallwysiad ymhlith achosion canlyniadau ensym annibynadwy, ochr yn ochr â reticwlocytosis ac ymyrraeth gan leukocytau.

Benywod heterosygaidd yw'r achos anoddaf. Mae anactifadu'r cromosom X ar hap yn cynhyrchu cymysgedd o gelloedd coch arferol a diffygiol, a gall y gweithgarwch cyffredinol fod unrhyw le rhwng diffygiol iawn ac ymddangosiadol arferol. Mae profion sgrinio ansoddol yn methu canfod ffenoteipiau canolradd yn rheolaidd. Mae dogfennaeth WHO ar brofion G6PD yn trafod y cyfyngiad hwn yn fanwl.

Mae oedran y sampl, y tymheredd storio, goddrychedd y pwynt terfyn gweledol, yr haematocrit ac ansawdd yr adweithyddion yn ychwanegu sŵn dadansoddol at yr effeithiau biolegol hyn.

Nid diagnosis yw sgrinio

Mae canlyniad sgrinio sy'n ddiffygiol, yn ganolradd neu'n anghyson â'r darlun clinigol yn galw am assay meintiol o'r ensym G6PD. Mae WHO yn ystyried sbectroffotometreg feintiol â thymheredd wedi'i reoli yn ddull cyfeirio. Yn yr assay hwnnw, ychwanegir glwcos-6-ffosffad a NADP+ at haemolysad celloedd coch, ac olrheinir y NADPH a ffurfir drwy'r cynnydd mewn amsugnedd ar 340 nm. Mae cyfradd y newid yn gymesur â gweithgarwch yr ensym, sydd fel arfer yn cael ei normaleiddio i haemoglobin fel unedau fesul gram. Ceir crynodeb o arfer cyfredol labordai clinigol yn y cofnod yng nghatalog profion Mayo ar gyfer gweithgarwch G6PD.

Wrth ddehongli, defnyddir ystod gyfeirio ddilysedig y labordy, a fynegir yn aml mewn perthynas â gweithgarwch arferol y boblogaeth, gyda diffyg yn cael ei drafod yn gyffredin ger y trothwy o 30 y cant a gweithgarwch canolradd uwchlaw hynny. Mae proffiliau cynnyrch targed WHO ar gyfer profion G6PD (2022) yn nodi'r fframwaith diagnostig hwnnw. Os yw haemolysis neu drallwysiad diweddar yn gwneud ffenoteipio'n annibynadwy, ailadroddwch y profion ar ôl i boblogaeth y celloedd coch ddychwelyd i gydbwysedd, a gall profion moleciwlaidd ychwanegu gwybodaeth heb ddisodli'r mesuriad ensym.

Ffin sy'n werth ei chadw

Mae glas methylen yn yr assayau hyn yn adweithydd labordy ex vivo. Mae'r ffaith honno'n perthyn i drafodaeth wahanol i ddiogelwch rhoi glas methylen i glaf, a drafodir mewn canllawiau ar wrtharwyddion glas methylen. Mae'r biocemeg yn cysylltu'r ddau, gan fod y cyffur hefyd yn dibynnu ar rydwytho sy'n ddibynnol ar NADPH, ond nid dos yn y llif gwaed yw llifyn mewn tiwb prawf. I gael cyd-destun ynghylch sut mae'r llifyn yn ymddwyn fel staen mewn lleoliad gwahanol, gweler egwyddorion staenio â glas methylen, ac ar gyfer y teulu cemegol y mae'n perthyn iddo, llifynnau rhydocs yn y labordy.

Mae sgrinio'n gofyn a yw'r gallu rhydwytho'n ymddangos yn gyflawn. Mae cadarnhau'n gofyn faint o ensym sydd yno mewn gwirionedd. Mae'r llifyn yn ateb y cwestiwn cyntaf yn dda, ar yr amod nad oes neb yn gofyn iddo ateb yr ail.