Glas methylen a signalau llidiol: inflammasomau, IL-6, a STAT3

Tybiwch fod tri labordy yn adrodd bod yr un cyfansoddyn glas yn wrthlidiol. Mae un yn dangos llai o IL-1beta o facroffagau. Mae un yn dangos llai o'r ensym iNOS yn yr un math o gell. Mae un yn dangos llai o IL-6 yn y gwaed a llai o weithgarwch STAT3 yn yr ymennydd. Y demtasiwn yw cyfuno'r tri yn un honiad. Mae'r cyfuno hwnnw'n cuddio'r canfyddiad.

Mae pob canlyniad yn perthyn i gysyniad signalau gwahanol, gyda'i sbardun, ei gam cydosod, a'i fesur canlyniad ei hun. Mae glas methylen yn gweithredu ar bob cysyniad ar bwynt gwahanol. Mae'r cwestiwn a yw unrhyw un o'r rhain yn gwella canlyniad iechyd yn gwestiwn ar wahân, a drafodir yn ein trosolwg o las methylen a llid. Mae'r dudalen hon yn canolbwyntio ar y llwybrau.

Llwybr 1: cydosod inflammasomau a caspase-1

Sgaffald protein a adeiledir yn ôl yr angen y tu mewn i gell myeloid yw inflammasom. Y cydrannau yw synhwyrydd, addasydd o'r enw ASC, ac ensym effeithydd o'r enw caspase-1. Ar ôl ei gydosod, mae caspase-1 yn hollti pro-IL-1beta a pro-IL-18 i greu eu ffurfiau sy'n cael eu secretu, a gall sbarduno pyroptosis, ffurf lidus ar farwolaeth celloedd. Y synhwyrydd sy'n diffinio'r math: mae NLRP3 yn ymateb i grisialau a thocsinau sy'n ffurfio mandyllau fel nigericin ac ATP, mae NLRC4 yn ymateb i flagellin bacteriol, mae AIM2 yn ymateb i DNA llinyn dwbl cytosolig, ac mae'r llwybr anghanonaidd yn ymateb i lipopolysacarid mewngellol.

Mae angen dau signal ar gyfer actifadu. Paratoi yw'r signal cyntaf: mae ligand derbynnydd tebyg i Toll yn ysgogi trawsgrifio NLRP3 a pro-IL-1beta sy'n ddibynnol ar NF-kB, fel bod y cydrannau'n bodoli. Cydosod yw'r ail signal: mae ail sbardun yn achosi i ASC oligomereiddio i greu smotiau, i caspase-1 gael ei hollti i greu ei ddarn p20, ac i IL-1beta p17 aeddfed gael ei ryddhau. Mae rhywogaethau ocsigen adweithiol mitocondriaidd a mewnlifiad crisialau yn ffactorau hysbys sy'n cyfrannu at yr ail signal ar gyfer NLRP3.

Profodd astudiaeth macroffagau 2017 o atal ystod eang o inflammasomau las methylen ar y ddau signal. Mewn macroffagau mêr esgyrn llygod a baratowyd â lipopolysacarid, ysgogodd nigericin, ATP, a chrisialau wrad monosodiwm ill tri ryddhau IL-1beta a caspase-1 ynghyd â ffurfio smotiau ASC, a gostyngodd glas methylen ar 20 i 200 micromolar y tri mewn modd dibynnol ar ddos heb ladd y celloedd. Dangosodd flagellin a Salmonella ar gyfer NLRC4, DNA llinyn dwbl a Listeria ar gyfer AIM2, a lipopolysacarid wedi'i drawsh heintio neu E. coli byw ar gyfer y llwybr anghanonaidd yr un patrwm. Ni sbardunodd y cyfansoddyn ar ei ben ei hun unrhyw ryddhau, ac ni ddangosodd platiau rheoli unrhyw effaith wrthfacteriol, felly mae'r canlyniad yn ymwneud ag ymateb y lletywr.

Yn gynharach yn y llwybr, mesurwyd tri ymyriad. Gostyngodd uwchocsid mitocondriaidd a ysgogwyd gan rotenone gyda glas methylen, a gostyngodd rhyddhau IL-1beta a ysgogwyd gan rotenone gydag ef. Gostyngodd mewnlifiad gleiniau fflworoleuol, yn gyson â llai o ffagocytosis cyn synhwyro crisialau. Dangosodd adroddydd a yrrwyd gan hyrwyddwr NLRP3 gyda dau safle NF-kB weithgarwch is gyda glas methylen, tra na ymatebodd hyrwyddwr byrrach heb y safleoedd hynny. Mewn tiwb heb gelloedd, gostyngodd glas methylen hefyd weithgarwch caspase-1 dynol ailgyfunol yn uniongyrchol. Roedd ychwanegu'r cyfansoddyn yn ystod y paratoi yn unig neu'r actifadu yn unig yn dal i leihau rhyddhau IL-1beta, IL-18, a caspase-1, felly mae'r ddau gam yn gysylltiedig.

Roedd y profion mewn llygod yn cyd-fynd â'r detholusrwydd hwn. Lladdodd dos marwol o lipopolysacarid y llygod rheoli o fewn oriau, tra bod glas methylen wedi gwella goroesiad; gostyngodd IL-1beta peritoneol ond ni ostyngodd IL-6 yn yr un hylif. Mewn model peritonitis Listeria, gostyngodd IL-1beta peritoneol tra bod cyfanswm nifer y celloedd yn ddigyfnewid. Ymddygodd monocytau THP-1 dynol fel macroffagau llygod ar draws y pedwar math o inflammasom. Mae canlyniad inflammasom yn egluro aeddfedu IL-1beta ac IL-18, nid pob cytocin; dyna hefyd pam mae siâp celloedd imiwn yr ymennydd mewn arbrofion microglia ac astrocytau yn ateb cwestiwn gwahanol i gydosod sgaffald.

Llwybr 2: trawsgrifio iNOS drwy rwymo NF-kB a STAT1

Prin fod synthas ocsid nitrig anwythadwy, neu iNOS, yn bresennol wrth orffwys, ac mae'n cael ei drawsgrifio yn ôl yr angen. Mae lipopolysacarid yn ei ysgogi'n bennaf drwy ddiraddio IkB-alpha, ac yna ffosfforyleiddio NF-kB a'i fynediad i'r cnewyllyn. Mae interfferon-gamma yn ei ysgogi'n bennaf drwy ffosfforyleiddio STAT1 gan ginas Janus, ac yna mynediad STAT1 i'r cnewyllyn. Yna mae pob ffactor yn rhwymo i'w safle ar hyrwyddwr iNOS. Mae gweithgarwch ensymau ac anwytho genynnau yn bwyntiau rheoli ar wahân, a gall cyffur weithredu ar y naill neu'r llall neu'r ddau.

Lleolodd astudiaeth 2015 o anwytho iNOS mewn macroffagau a llygod ag endotocsemia yr effaith ar lefel y neges. Mewn celloedd RAW 264.7 a macroffagau cynradd llygod, gostyngodd 1 micromolar o las methylen a roddwyd 30 munud cyn lipopolysacarid, interfferon-gamma, neu'r ddau, brotein iNOS ac mRNA dros 8 i 24 awr, gyda llai o nitraid yn y cyfrwng a dim colli hyfywedd. Mewn llygod a gafodd 25 mg per kg o lipopolysacarid, gostyngodd dos unigol o 5 mg per kg awr ynghynt brotein iNOS ac mRNA yn yr ysgyfaint, yr afu, a'r galon.

Y manylyn nodedig yw'r hyn na newidiodd. Parhaodd diraddio IkB-alpha, ffosfforyleiddio NF-kB, ffosfforyleiddio STAT1, a chronni'r naill ffactor neu'r llall yn y cnewyllyn fel arfer. Daeth y tarfu un cam yn ddiweddarach: dangosodd echdyniadau niwclear lai o rwymo NF-kB i'w elfen DNA ar ôl lipopolysacarid a llai o rwymo STAT1 ar ôl interfferon-gamma, a chadarnhaodd imiwn waddodi cromatin lai o feddiannu hyrwyddwr iNOS gan y naill ffactor neu'r llall y tu mewn i gelloedd. Gostyngodd ffactor necrosis tiwmor alffa, y mae ei hyrwyddwr hefyd yn defnyddio NF-kB, yn ogystal. Roedd y ffactorau wedi'u hactifadu ac wedi cyrraedd, ond roedd eu rhwymo i'w DNA targed yn wan.

Sylwch ar y gwahaniaeth o gymharu â llwybr 1. Mae hwn yn ymwneud â rhwymo ffactorau i DNA, yn defnyddio STAT1 yn hytrach na STAT3, ac yn mesur mRNA, protein, a nitraid yn hytrach na smotiau ASC a darnau caspase-1. Mae ein map o dargedau glas methylen ar draws modelau celloedd yn cadw'r lefel drawsgrifio hon ar wahân i fesuriadau uniongyrchol o ensymau a mitocondria.

Llwybr 3: IL-6 serwm ac actifadu STAT3 mewn meinweoedd

Mae IL-6 yn trosglwyddo signalau drwy deulu derbynyddion gp130 i raeadr cinas Janus i STAT3. Mae STAT3 wedi'i ffosfforyleiddio yn deuoli, yn mynd i mewn i'r cnewyllyn, ac yn ysgogi rhaglenni llidiol, tra bod IL-6 ei hun yn darged NF-kB, felly mae'r ddau'n ffurfio dolen adborth a elwir yn aml yn echelin IL-6 i STAT3. Y mesurau canlyniad safonol yw IL-6 serwm yn gynharach yn y llwybr, cymhareb STAT3 wedi'i ffosfforyleiddio i gyfanswm STAT3, ac ensymau effeithydd fel iNOS a COX2 yn ddiweddarach yn y llwybr.

Mesurodd astudiaeth llygod 2023 o IL-6 a STAT3 ar ôl lipopolysacarid yr echelin ar draws gwahanol adrannau. Cafodd llygod C57BL/6 gwrywaidd 1 mg per kg o lipopolysacarid bob dydd am dri diwrnod, gyda 5 neu 10 mg per kg o las methylen 30 munud ar ôl pob dos. Ar y trydydd diwrnod, roedd IL-6 serwm yn is yn y ddau grŵp glas methylen na chyda lipopolysacarid yn unig, tra na newidiodd y rhan fwyaf o'r cytocinau eraill yn y panel gyda'r driniaeth. Roedd cymarebau STAT3 wedi'i ffosfforyleiddio i gyfanswm STAT3 yn is yn y cortecs, yr hipocampws, a chroen y glust, gyda llai o staenio microgliaidd Iba-1, llai o iNOS a COX2, a cholli pwysau wedi'i liniaru'n rhannol.

Mae dau rybudd yn briodol yma. Mae IL-6 serwm is ynghyd â llai o ffosfforyleiddio STAT3 mewn meinweoedd yn cyd-fynd ag addasu'r echelin, ond nid yw'n ynysu'r prif bwynt gweithredu, gan y gallai llai o gytocin yn gynharach yn y llwybr, llai o signalau drwy dderbynyddion, neu newid mewn gweithgarwch ffosffatas oll gynhyrchu'r un gymhareb. Ac mae pwysau dros dri diwrnod o her acíwt yn fesur canlyniad ar lefel yr anifail cyfan, nid sgôr symptomau neu ryddhad. Mae'n ychwanegu cyd-destun y tu hwnt i blot heb droi canlyniad signalau yn honiad am driniaeth. Mae cemeg ar wahân rheoli rhydocs mitocondriaidd yn digwydd ochr yn ochr â'r disgrifiad hwn o gytocinau, ac ni ddylid ei chyfuno ag ef.

Cymharu llwybrau: pwyntiau ymyrryd a mesurau canlyniad

Mae'r tabl yn atal tri throsglwyddiad annilys. Nid yw canlyniad smotiau ASC yn profi canlyniad STAT3. Nid yw canlyniad STAT1 yn rhwymo i hyrwyddwr iNOS yn profi canlyniad STAT3, er bod y ddau brotein yn aelodau o deulu STAT. Nid yw canlyniad IL-6 serwm yn profi llai o gydosod inflammasomau: yn yr arbrawf peritoneol, gostyngodd IL-1beta tra na ostyngodd IL-6. Mae angen ei sbardun a'i fesur canlyniad ei hun ar bob rhes, a dyna pam, wrth ddarllen astudiaethau glas methylen mewn celloedd, anifeiliaid, a lleoliadau clinigol, mae'n hanfodol paru pob honiad â'r lefel a fesurwyd.

Nid yw dim o hyn yn sefydlu dosio, diogelwch, na budd mewn pobl. Sbardunau rheoledig ar gyfer profi mecanwaith yw modelau lipopolysacarid, nid efelychiadau o salwch cronig, ac mae dosio ochr yn ochr â'r sbardun yn profi atal newid a ysgogwyd yn hytrach na gwrthdroi clefyd sefydledig. Cadwch y disgrifiad hwn o fecanweithiau ar wahân i ganlyniadau cleifion, a barnwch unrhyw honiad iechyd yn ôl yr astudiaeth cleifion sy'n sail iddo.