Mesur effeithiau mitocondriaidd glas methylen: ocsigen, ATP, a photensial pilen

Tybiwch fod labordy yn ychwanegu glas methylen at fitocondria â nam ar eu resbiradaeth ac yn gweld y defnydd o ocsigen yn cynyddu. Y frawddeg naturiol i'w hysgrifennu yw bod y llifyn wedi adfer gweithrediad mitocondriaidd. Gall y frawddeg honno fod yn anghywir. Mae fflwcs ocsigen, synthesis ATP, a photensial pilen yn dri chysyniad gwahanol. Maent yn rhannu'r un organyn yn yr un modd ag y mae gwneud copi wrth gefn, cysoni, a rhannu yn defnyddio'r un ffolder cwmwl: maent yn gysylltiedig, ond yn cael eu llywodraethu gan reolau gwahanol. Os cymysgir un â'r llall, mae'r dehongliad yn methu, hyd yn oed pan fo pob mesuriad yn dechnegol gywir.

Mae glas methylen yn gwneud y dryswch hwn yn debygol oherwydd ei fod yn cymryd rhan yn y system y mae'n ei mesur. Mae'n gyfrwng cylchu rhydocs sy'n derbyn electronau yn gynharach yn y gadwyn ac yn eu rhoi yn ddiweddarach, yn gation lipoffilig sy'n cronni mewn mitocondria wedi'u hegnioli, ac yn gyfansoddyn glas cryf sy'n amsugno ac yn allyrru golau yn yr un bandiau â chwiliedyddion cyffredin. Ni all un darlleniad ymdopi â'r holl gymhlethdod hwn. Y patrwm dibynadwy, a ddangosir ar draws astudiaethau mitocondriaidd Budapest, yw mesur fflwcs ocsigen ynghyd â chyfradd synthesis ATP, potensial pilen, a rhyddhau hydrogen perocsid, gyda rheolyddion penodol i'r llifyn ar bob cam.

Mae respirometreg yn mesur fflwcs ocsigen, nid allbwn egni

Mae respirometreg cydraniad uchel, boed drwy Oroboros Oxygraph neu ddadansoddwr fflwcs allgellog Seahorse, yn adrodd un peth: pa mor gyflym y mae ocsigen yn cael ei rydwytho. Nid yw'n adrodd faint o brotonau a bwmpiwyd fesul electron, faint o'r graddiant a gadwyd, nac a ddefnyddiodd synthas ATP ef.

Mae'r eirfa'n bwysig. Mewn mitocondria ynysig, mae swbstrad heb ADP yn rhoi resbiradaeth gollyngiad, mae swbstrad gydag ADP ar lefel ddirlenwi yn rhoi capasiti ffosfforyleiddio ocsidiol, ac mae titradiad â dadgyplwr yn rhoi'r capasiti trosglwyddo electronau mwyaf. Mewn celloedd cyflawn, y mesurau cyfatebol gan Seahorse yw resbiradaeth sylfaenol, resbiradaeth gysylltiedig ag ATP sy'n sensitif i oligomycin, gollyngiad protonau, resbiradaeth fwyaf a ddiffinnir gan FCCP, a defnydd ocsigen anfitocondriaidd sy'n gwrthsefyll rotenone ynghyd ag antimycin. Mae galw allbynnau Seahorse yn Gyflwr 3 a Chyflwr 4 yn benthyg cywirdeb nad yw'r paratoad yn ei gefnogi, fel y mae fframwaith Mito Stress Test Agilent yn ei egluro.

Mae glas methylen yn torri'r cysylltiad greddfol rhwng mwy o ocsigen a mwy o egni. Mewn mitocondria ynysig o ymennydd moch cwta, cynyddodd 100 nM i 1 uM o'r llifyn y defnydd o ocsigen wrth orffwys gyda swbstradau glwtamad ynghyd â malad, swcsinad, ac alffa-glyseroffosffad, gyda chynnydd o tua 64 y cant ar alffa-glyseroffosffad, ond arhosodd resbiradaeth wedi'i hysgogi gan ADP mewn mitocondria iach yn ddigyfnewid i bob pwrpas, yn ôl yr astudiaeth o fitocondria ynysig yr ymennydd. Gan fod y gollyngiad wedi cynyddu tra bo'r fflwcs a ysgogwyd gan ADP wedi aros yn wastad, mae'r gymhareb rheolaeth resbiradol a gyfrifir yn gostwng. Nid yw'r gostyngiad hwnnw'n golygu bod y llifyn wedi niweidio'r mitocondria. Mae'n golygu bod y llifyn wedi ychwanegu cylch rhydocs sy'n defnyddio ocsigen ar ben resbiradaeth arferol. Mae prawf defnydd ocsigen glas methylen sy'n adrodd y cynnydd yn unig wedi mesur cemeg go iawn heb ddweud dim am gadw egni.

Mae'r arbrofion adfer yn dangos yr un bwlch ar raddfa fwy. Gyda Chymhlyg I wedi'i rwystro, adferodd fflwcs ocsigen tua thair gwaith tra bo synthesis ATP wedi adfer dim ond tua 1.5 gwaith. Cyrhaeddodd mwy o ocsigen yr electrod. Cyfrannodd llai ohono at gynhyrchu ATP. Mae angen ochr ATP y cyfrif ar unrhyw honiad o well ffosfforyleiddio ocsidiol, yn ddelfrydol wedi'i fynegi fel cymhareb ATP fesul ocsigen gyda chonfensiwn yr enwadur wedi'i nodi.

Mae profion ATP yn mesur cyfradd synthesis, ac ni all y cynnwys gymryd ei lle

Mae prawf ATP yn ateb cwestiwn gwahanol: faint o ATP a gynhyrchir fesul uned o amser. Mae darlleniad cinetig, naill ai ymoleuedd lwcifferas pryfed tân wedi'i olrhain dros funudau neu brawf cypledig hecsocinas ynghyd â dehydrogenas glwcos-6-ffosffad wedi'i ddarllen ar 340 nm, yn rhoi cyfradd. Mae un mesuriad o gyfanswm ATP ar bwynt terfyn yn rhoi cynnwys, sy'n adlewyrchu synthesis llai defnydd ac yn dweud fawr ddim wrthych am ffosfforyleiddio ocsidiol ar ei ben ei hun.

Defnyddiodd grŵp Budapest y dull ensymatig cypledig gyda chinas adenylad wedi'i atal, a chanfod bod glas methylen ar 1 i 2 uM yn cynyddu cynhyrchiant ATP yn gymedrol ond yn sylweddol mewn mitocondria wedi'u trin â rotenone ac antimycin. Adferiad gwirioneddol yw hynny, ac mae'n rhannol. Cyrhaeddodd yr astudiaeth o wenwyndra TEGDMA yr un math o ateb mewn model gwahanol: gostyngodd 5 mM o'r monomer deintyddol TEGDMA resbiradaeth gysylltiedig â Chymhlyg I o tua 286 i 28 uned fflwcs, ac adferodd 2 uM o'r llifyn hi i tua 86.

Mae dau reolydd yn anhepgor gyda chyfansoddyn rhydocs lliw. Yn gyntaf, defnyddiwch oligomycin i bennu faint o'r synthesis ATP a fesurir sy'n dibynnu ar synthas ATP. Yn ail, cynhaliwch brawf adfer ychwanegiad heb gelloedd gydag ATP o swm hysbys ynghyd â'r adweithydd cyflawn a'r union grynodiadau llifyn a ddefnyddir, sef o leiaf 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM, a 2 uM. Gall y llifyn amsugno golau a allyrrir, atal yr ensym adrodd, neu newid cemeg rhydocs yr adweithydd, ac mae canllawiau cyffredinol ar brofion lwcifferas yn argymell gwrth-sgrinio biocemegol ar gyfer yr union fath hwn o ymyrraeth. Peidiwch â chymryd bod 1 uM yn rhydd o arteffactau oherwydd bod diffodd fel arfer yn waeth ar grynodiadau uwch.

Mae chwiliedyddion potensial pilen yn mesur dosbarthiad llifyn, nid fflwcs

Mae saffranin O, TMRM a TMRE, rhodamin 123, a JC-1 i gyd yn gationau sy'n gallu treiddio drwy bilenni. Maent yn cronni yn y matrics â gwefr negatif yn ôl ecwilibriwm electrocemegol, felly mae fflworoleuedd swmp yn adrodd y potensial yn anuniongyrchol drwy leoliad y chwiliedydd. Nid oes yr un ohonynt yn mesur ATP na fflwcs electronau.

Mae gan bob chwiliedydd baratoad sy'n gweddu orau iddo. Mae saffranin O yn addas ar gyfer mitocondria ynysig a chelloedd wedi'u gwneud yn athraidd, fel arfer ar tua 2 uM gydag ysgogiad ger 495 nm ac allyriad ger 585 nm, gan weithredu mewn modd diffodd lle mae mewnlifiad yn newid fflworoleuedd swmp. Mae TMRM a TMRE yn addas ar gyfer celloedd cyflawn gyda llwytho nanomolar isel mewn modd nad yw'n diffodd, lle mae dadbolareiddio yn rhyddhau'r llifyn ac mae fflworoleuedd mitocondriaidd yn gostwng; wrth lwytho'n uchel, gall cyfeiriad y signal wrthdroi drwy hunan-ddiffodd. Mae JC-1 yn rhoi cymhareb gwyrdd i goch gyfleus ond mae'n dibynnu ar lwytho a màs mitocondriaidd, sy'n ei wneud yn wannach ar gyfer gwaith meintiol na TMRM wedi'i reoli'n ofalus. Crynhoir y cyfaddawdau hyn mewn adolygiad a ddefnyddir yn helaeth o chwiliedyddion potensial pilen mitocondriaidd.

Mae glas methylen yn ymyrryd yn optegol ar yr union grynodiadau gweithio. Mae ei fandiau amsugno ger 600 i 665 nm yn gorgyffwrdd ag allyriad coch chwiliedyddion, felly mae effeithiau hidlydd mewnol, diffodd, ac amsugno golau ysgogi oll yn bosibl. Mae'r llifyn hefyd yn ail gation lipoffilig y mae ei ddosbarthiad ei hun yn newid gyda'r potensial sy'n cael ei fesur. Yr amddiffyniad yw mesuriadau ategol ynghyd â samplau gwag: y chwiliedydd yn unig, y llifyn yn unig, y chwiliedydd ynghyd â phob crynodiad llifyn, dadbolareiddio llawn gyda FCCP fel cyfeirnod sero, ac yn ddelfrydol ail chwiliedydd sy'n wahanol yn optegol. Gosododd yr astudiaeth osgoi Cymhlyg III y cynsail hwnnw drwy ailadrodd yr adferiad potensial pilen gyda saffranin O a TMRM ar ôl ataliad gan antimycin a myxothiazol, a chael yr un adferiad ansoddol. Mae un cyfrwng adrodd optegol yn awgrym. Mae dau gyfrwng adrodd annibynnol yn dystiolaeth.

Tri pharatoad, tri chwestiwn gwahanol

Nid yw mitocondria ynysig, celloedd wedi'u gwneud yn athraidd, a chelloedd cyflawn yn osodiadau sensitifrwydd cyfnewidiol ar un prawf. Maent yn gysyniadau gwahanol gydag egwyddorion gweithredol gwahanol.

Mae mitocondria ynysig yn cadw'r gadwyn cludo electronau, y bilen fewnol, a pheirianwaith y matrics wrth dynnu'r bilen plasma, y cytosol, a phensaernïaeth y rhwydwaith ymaith. Y tynnu ymaith hwnnw yw'r pwynt: diffinnir swbstradau, ADP, atalyddion, a chrynodiadau llifyn yn union, fel y gellir pennu llwybr. Y gost yw colli'r cyflenwad swbstrad brodorol, signalau, a galw.

Mae celloedd wedi'u gwneud yn athraidd yn cadw mitocondria y tu mewn i lawer o'u pensaernïaeth gellog, gan adael i swbstradau alldarddol ac ADP fynd drwy'r bilen plasma sydd wedi'i hagor. Dyma'r offeryn cywir ar gyfer pennu nam mewn llwybr swbstrad o fewn cyd-destun cellog. Mae gwneud celloedd yn rhy athraidd yn niweidio'r bilen allanol, ac mae rheoleiddio cytosolaidd yn cael ei olchi allan.

Mae celloedd cyflawn yn cadw popeth: rhwystr y bilen plasma, rhydwythyddion cytosolaidd, cludiant swbstradau mewndarddol, y rhwydwaith mitocondriaidd, a'r galw am ATP. Hwy sydd agosaf at ffisioleg ac ymhellaf oddi wrth fecanwaith, oherwydd bod mewnlifiad, rhydwythiad, ac atafaeliad y llifyn oll yn llywio'r amlygiad mitocondriaidd effeithiol.

Defnyddiodd astudiaeth TEGDMA y tair lefel yn fwriadol: mitocondria ynysig yr ymennydd ar gyfer adfer ocsidiad a photensial gan y llifyn, bôn-gelloedd mwydion deintyddol wedi'u gwneud yn athraidd yn bennaf i leoli'r nam mewn ocsidiad swbstradau cysylltiedig â Chymhlyg I, a bôn-gelloedd cyflawn ar gyfer effaith ffisiolegol net 2 uM o'r llifyn ar ddefnydd ocsigen wedi'i atal. I ddarllenwyr sy'n cymharu darlleniadau mitocondriaidd ar draws paratoadau, mae'r esboniad cydymaith ar sut mae glas methylen yn symud electronau drwy'r gadwyn resbiradol yn rhoi cefndir y llwybrau, ac mae'r canllaw i ddarllen astudiaethau resbiradaeth glas methylen yn trafod rhesymeg dosau ac atalyddion.

Y rheolyddion sydd eu hangen ar gyfer llifyn rhydocs-weithredol

Mae angen rhestr hirach o reolyddion ar gyfrwng cylchu rhydocs nag ar atalydd cyffredin, oherwydd gall cemeg y llifyn yn unig efelychu bioleg.

Ar gyfer respirometreg, defnyddiwch siambr â byffer yn unig i fesur drifft, siambr â byffer a llifyn heb ddeunydd biolegol, llifyn ynghyd ag unrhyw rydwythydd allgellog sy'n bresennol yn y prawf, a rotenone ynghyd ag antimycin ar y diwedd i ddiffinio defnydd ocsigen anfitocondriaidd mewn celloedd cyflawn. Sylwch fod llifyn wedi'i rydwytho yn ailocsidio drwy drosglwyddo electronau i ocsigen i ffurfio hydrogen perocsid, felly mae sampl wag â llifyn yn unig heb roddwr electronau yn tanamcangyfrif y sinc ocsigen heb gelloedd sy'n ymddangos pan fydd NADH neu NADPH ar gael.

Ar gyfer hydrogen perocsid, ffafriwch Amplex UltraRed wedi'i galibro ynghyd â pherocsidas rhuddygl poeth dros lifynnau DCFDA nad ydynt yn ddetholus, gwiriwch gyda catalas, a phrofwch ddibyniaeth ar oleuo, gan fod y llifyn yn ffotosensiteiddiwr. Canfu astudiaeth mitocondria'r ymennydd fod baich perocsid wedi cynyddu fwy na phedair gwaith gyda dim ond 100 nM o'r llifyn tra bod ei ddileu wedi arafu, gyda pherocsid yn cael ei ffurfio'n uniongyrchol gan lifyn wedi'i rydwytho heb uwchocsid fel canolradd. Mae manylion dewis chwiliedyddion a rheolyddion golau yn perthyn i'r erthygl gydymaith ar fesur rhywogaethau ocsigen adweithiol mewn arbrofion â llifynnau, a thrafodir y cwestiwn ehangach ynghylch pryd mae perocsid yn gweithredu fel signal yn hytrach na baich ochr yn ochr â chydbwysedd rhydocs cellog a honiadau gwrthocsidiol.

Ar gyfer honiadau am lwybrau, profwch y ddau safle atalydd Cymhlyg III: antimycin A ar safle Qi a myxothiazol ar safle Qo, ynghyd â phwynt terfyn Cymhlyg IV gyda cyanid. Adroddodd astudiaeth gynharach o ymennydd llygod fod y llifyn yn adfer resbiradaeth a rwystrodd rotenone ond nid resbiradaeth a rwystrodd antimycin, tra canfu'r astudiaeth ddiweddarach o dair rhywogaeth adferiad rhannol gyda'r ddau atalydd a thystiolaeth o rydwythiad uniongyrchol cytocrom c. Triniwch yr osgoi fel rhywbeth sy'n gyson â'r data mwy newydd yn hytrach na rhywbeth sydd wedi'i gadarnhau'n derfynol, gan fod crynodiad y llifyn, safle'r atalydd, cyflwr y swbstrad, a dosbarthiad y llifyn oll yn newid y llwybr a arsylwir.

Matrics dewis profion

Defnyddiwch y tabl hwn i ddewis y mesuriad ar sail y cwestiwn, nid y ffordd arall.

Yr isafswm ar gyfer honiad argyhoeddiadol yw defnyddio'r un crynodiadau llifyn, 100 nM, 300 nM, 1 uM, a 2 uM, i fesur fflwcs ocsigen dan amodau gollyngiad, ADP, oligomycin, a dadgyplwr, cyfradd synthesis ATP, potensial pilen gyda dau chwiliedydd os oes modd, a rhyddhau perocsid wedi'i galibro gyda chatalas a rheolyddion heb gelloedd. Adroddwch y set gysylltiedig: fflwcs ocsigen ynghyd â chyfradd ATP, ATP fesul ocsigen, potensial, a pherocsid. Mae unrhyw un o'r rhifau hynny ar ei ben ei hun yn fesuriad sy'n chwilio am ystyr.