Llunio cromlin raddnodi glas methylen: samplau gwag, amrediad, a llinoledd

Mae dau ddadansoddwr yn rhannu un botel o hydoddiant stoc glas methylen, ac mae pob un yn llunio cromlin raddnodi. Mae'r cyntaf yn cael llinell syth drwy'r tarddbwynt ac yn mesur samplau anhysbys yn hyderus. Mae'r ail yn cael llinell sy'n plygu ar y pen uchaf, rhyngdoriad nad yw'n agos at sero, a chanlyniadau samplau sy'n drifftio wrth wanhau. Yr un llifyn, yr un offeryn, yr un donfedd. Nid medr yw'r gwahaniaeth. Y dyluniad sydd i gyfrif: beth a roddwyd yn y sampl wag, pa grynodiadau a ddewiswyd, ac a arhosodd yr amrediad a wiriwyd o fewn y rhanbarth lle mae un model syml yn dal yn ddilys.

Mae cromlin raddnodi yn gontract rhwng ymateb offeryn a chrynodiad, ac mae'n ddilys dim ond o dan yr amodau y cafodd ei llunio ynddynt. Ar gyfer glas methylen, mae gan y contract hwnnw wendid hysbys. Mae'r llifyn yn hunangysylltu mewn dŵr, felly mae'r rhywogaeth sy'n amsugno yn newid gyda'r crynodiad. Ni fydd cromlin a luniwyd ar draws y newid hwnnw yn syth, ac ni all unrhyw faint o ystadegau ei chywiro. Mae'r erthygl hon yn dangos sut i ddylunio'r gromlin fel bod y llinell yn ystyrlon: dewis y sampl wag gywir, cadw'r amrediad o fewn y parth monomer, gwneud ailadroddiadau gonest, a dehongli crymedd fel gwybodaeth yn hytrach na sŵn.

Dechreuwch gyda'r sampl wag, nid y safonau

Mae'r sampl wag yn diffinio sero, ac ar gyfer glas methylen rhaid iddi gynnwys popeth heblaw'r llifyn. Yr un radd o ddŵr, yr un byffer a pH, yr un halwynau, yr un gyfran o gyd-doddydd, yr un tymheredd. Paratowch y samplau graddnodi yn yr union fatrics hwnnw. Rheswm cemegol sydd dros hyn, nid un biwrocrataidd. Mae halen a thoddydd yn symud y cydbwysedd rhwng monomer, dimer, ac agregau uwch, sy'n newid y sbectrwm ar y donfedd fesur. Ni all sampl wag sy'n cynnwys dŵr yn unig gywiro newid yn nosbarthiad y rhywogaethau a achosir gan y matrics. Amrywiodd y dadansoddiad cyffredinol o sbectra glas methylen mewn dŵr, sydd ar gael drwy ei gofnod mynediad agored, sodiwm clorid o 0 i 0.15 M yn union oherwydd bod cryfder ïonig yn symud yr ecwilibriwm, a chynyddodd yr agregu gyda'r halen.

Un canlyniad ymarferol: peidiwch byth â graddnodi mewn dŵr dadïoneiddiedig ac yna fesur samplau mewn byffer ffosffad neu hidlif dŵr gwastraff. Pan nad oes matrics heb ddadansoddyn ar gael, mae ychwanegu safon at y sampl ei hun yn well na chromlin allanol nad yw'n cyfateb. Mae canllawiau cysylltiedig ar sicrhau cywirdeb profion meintiol dyfrllyd yn y drafodaeth ar fatricsau ac ymyriant, ac ymdrinnir ag egwyddorion cyffredinol profion meintiol ar lifynnau yn y trosolwg o ddylunio profion.

Dewiswch amrediad lle mae un rhywogaeth yn dominyddu

Mae meintioli yn y band tonfedd hir ger 664 nm yn rhagdybio bod y rhan fwyaf o'r llifyn ar ffurf monomer. Mewn dŵr plaen, dim ond tra bo hydoddiannau'n aros yn wanedig, yn fras yn y rhanbarth micromolar isel, y mae'r rhagdybiaeth honno'n ddilys. Mae llethrau empirig cyhoeddedig yn dangos y ffin: mae graddnodiadau a gedwir o dan tua 7 micromolar mewn celloedd 1 cm yn rhoi llethr ger 82,000 M-1 cm-1, tra bo graddnodiad a estynnir hyd at tua 37 micromolar yn gostwng i oddeutu 67,100 oherwydd bod y safonau uchaf eisoes yn cynnwys cryn dipyn o dimer. Mae'r amodau wedi'u nodi ar gyfer pob cyfernod a ddyfynnir yma yn y cyfeirnod sbectrol ar gyfer glas methylen, sef y lle iawn i gymharu rhifau; dim ond i bennu'r amrediad y mae'r erthygl hon yn eu defnyddio.

Mae'r rheolau dylunio yn dilyn yn uniongyrchol:

1. Cadwch y safon uchaf yn ddigon gwanedig i sicrhau bod siâp y sbectrwm yn sefydlog. Wrth ddatblygu'r dull, sganiwch yr amrediad gweladwy cyfan (tua 550 i 750 nm) ar gyfer pob lefel yn hytrach na darllen un donfedd. Os yw sbectra wedi'u normaleiddio yn newid siâp gyda'r crynodiad, mae'r cemeg yn newid ac mae'r amrediad yn rhy eang.
2. Traciwch gymhareb yr amsugnedd ger 610 nm i'r amsugnedd ger 665 nm ar draws y lefelau. Mae cymhareb sy'n codi gyda'r crynodiad yn golygu bod ysgwydd y dimer yn tyfu a bod y model monomer yn methu. Eglurir yr arwydd diagnostig hwn ymhellach yn y canllaw i agregu ac effeithiau crynodiad.
3. Defnyddiwch gell 1 cm ar gyfer gwaith micromolar isel. Gyda llethr ger 82,000, mae 5 micromolar yn rhoi amsugnedd ger 0.41 ac mae 10 micromolar yn rhoi tua 0.82, y ddau yn gyfforddus o fewn gallu'r rhan fwyaf o offerynnau.
4. Ar gyfer hydoddiannau stoc crynodedig, cwtogwch y llwybr yn hytrach na derbyn amsugnedd ymhell uwchlaw 1, ond cofiwch fod llwybr byr yn cywiro'r ffotometreg, nid y cemeg. Mae agregu yn dibynnu ar grynodiad, nid hyd llwybr, felly mae hydoddiant stoc crynodedig yn dal i fod angen triniaeth benodol sy'n ystyried dosbarthiad y rhywogaethau, yn hytrach na chromlin monomer wanedig.

Roedd y ffit cyffredinol sydd wrth wraidd llawer o'r darlun hwn yn cwmpasu 224 o sbectra o 1.1 micromolar i 3.4 millimolar, a chanfuwyd bod signal tetramer eisoes yn ganfyddadwy o dan 34 micromolar. Mae'r canfyddiad hwnnw'n gosod y cywair: mae'r ffenestr linol yn gulach nag y mae greddf yn ei awgrymu, felly gwiriwch hi yn hytrach na'i rhagdybio.

Lefelau, ailadroddiadau, a threfn

Nid yw cromlin â thri phwynt yn profi dim. Mae canllawiau dilysu ICH Q2(R2) yn gofyn am o leiaf bum crynodiad i asesu llinoledd, ac mae chwech i wyth lefel nad ydynt yn sero yn rhoi cromlin weithio fwy argyhoeddiadol, yn enwedig ger y pen uchaf lle mae agregu'n dechrau. Dosbarthwch y lefelau i gwmpasu'r amrediad samplau arfaethedig, gyda mwy o lefelau lle mae crymedd yn fwyaf tebygol, nid mewn cyfres geometrig a ddewiswyd er hwylustod.

Mesurwch bob lefel ddwywaith neu deirgwaith, gan baratoi pob ailadroddiad yn annibynnol yn hytrach na darllen dair gwaith o un fflasg. Mae ailadroddiadau annibynnol yn datgelu gwallau paratoi; dim ond sŵn yr offeryn y mae darlleniadau ailadroddus o un fflasg yn ei ddatgelu. Mesurodd astudiaeth gyffredinol 2020 bob hydoddiant dair gwaith, sy'n dal yn ddewis diofyn cadarn. Rhowch y darlleniadau mewn trefn ar hap fel na all drifft, arsugniad ar wydr, na newid tymheredd ymddangos yn grymedd. Canfu astudiaeth o giwvetau cwarts fod tua 3 y cant o'r llifyn yn arsugno o hydoddiant 34 micromolar o fewn 10 munud, felly cadwch yr amser cyswllt, y ciwvet, y glanhau, a'r dilyniant yn gyson drwy gydol y rhediad.

Enghraifft ddarluniadol wedi'i gweithio (nid data wedi'u mesur)

Mae'r rhifau isod wedi'u dyfeisio i ddangos y rhifyddeg. Nid mesuriadau labordy ydynt ac ni ddylid eu dyfynnu fel data glas methylen. Yr hyn sy'n bwysig yw patrwm y gwiriadau o'u cwmpas.

Tybiwch fod chwe safon mewn byffer cyfatebol, â llwybr 1 cm, yn cael eu darllen ar 665 nm yn erbyn y sampl wag gyfatebol:

Mae ffit llinell syth o'r amsugnedd cymedrig yn erbyn crynodiad yn rhoi llethr ger 0.0805 o unedau amsugnedd fesul micromolar a rhyngdoriad o fewn ychydig o unedau miliamsugnedd i sero. Mae rhannu'r llethr â hyd y llwybr yn ei drosi'n gyfernod amsugno ymddangosiadol: mae 0.0805 fesul micromolar yn cyfateb i tua 80,500 M-1 cm-1, sy'n gyson â chyfwng lle mae'r monomer yn dominyddu mewn dŵr. Nid R sgwâr yw'r gwiriad sy'n bwysig, gan y bydd hwnnw'n edrych yn ardderchog y naill ffordd neu'r llall. Y gwiriadau pwysig yw'r rhyngdoriad sydd bron yn sero, y gymhareb A610/A665 wastad ar draws S2 hyd at S5, a gweddillion wedi'u gwasgaru heb duedd. Mae'r cynnydd bach yn y gymhareb yn S6 yn arwydd gonest i naill ai hepgor y lefel honno neu nodi 7 micromolar fel terfyn uchaf dros dro ar gyfer y cyfuniad hwn o fatrics ac offeryn.

Mae darlleniad o 0.245 ar gyfer sampl anhysbys o dan amodau union yr un fath yn trosi'n uniongyrchol: mae 0.245 wedi'i rannu â 0.0805 fesul micromolar yn rhoi tua 3.0 micromolar, cyn cymhwyso unrhyw ffactor gwanhau sampl. Adroddwch y canlyniad ynghyd â'i amodau: tonfedd, llwybr, matrics y sampl wag, cyfwng graddnodi, a dyddiad.

Taflen waith graddnodi i'w llenwi

Copïwch y templed hwn i gofnod y labordy ar gyfer pob matrics newydd. Un matrics, un daflen, un gromlin.

Mae rhes ffurf yr adweithydd yn haeddu ei lle. Gall glas methylen masnachol fod yn halen anhydrus neu'n hydrad fel y trihydrad, ac mae'r màs molar anghywir yn gogwyddo pob crynodiad enwol yn dawel. Ymdrinnir â gwiriadau purdeb a manyleb y deunydd cychwynnol yn y canllaw ansawdd a gradd.

Gwiriwch gyda safon wirio annibynnol

Ni ddylai cromlin raddnodi byth farcio ei gwaith ei hun. Ar ôl ffitio, paratowch un safon wirio o hydoddiant stoc a baratowyd drwy bwyso ar wahân, ar grynodiad ger canol y cyfwng a dderbyniwyd, a darllenwch hi fel sampl anhysbys. Mae cytundeb o fewn ychydig y cant yn cadarnhau'r gadwyn baratoi; mae diffyg cytundeb yn awgrymu mai'r hydoddiant stoc neu'r gwanediadau, yn hytrach na'r offeryn, sydd ar fai. Ailadroddwch y safon wirio gyda phob swp o samplau. Os yw'n drifftio tra bo'r gromlin heb newid, amheuwch yr hydoddiannau gweithio neu'r ciwvet cyn amau'r samplau. Mae'r un arfer hwn yn dal y rhan fwyaf o'r gwallau cudd: defnyddio màs molar hydrad ar gyfer potel o ddeunydd anhydrus, micropiped sydd heb ei raddnodi'n gywir, neu fyffer a baratowyd â'r cryfder ïonig anghywir. Cofnodwch adferiad y safon wirio ar y daflen waith wrth ymyl y llethr, fel y gall darllenydd diweddarach weld bod y llinell wedi'i phrofi, nid dim ond ei llunio.

Dehongli aflinoldeb fel diagnosis

Pan fydd y gromlin yn plygu, mae siâp y methiant yn nodi'r achos. Mae crymedd tuag i lawr ar amsugnedd uchel gyda siâp sbectrol heb newid yn awgrymu mai'r offeryn sydd ar fai, yn aml oherwydd golau crwydr sy'n gogwyddo darlleniadau amsugnedd cryf tuag i lawr. Mae crymedd ynghyd ag ysgwydd gynyddol ar 610 nm yn awgrymu mai'r cemeg sydd ar fai: dimer ac agregau uwch yn amsugno'n wahanol i'r monomer. Mae sampl wag nad yw'n darllen sero, neu safonau y mae eu darlleniadau'n gostwng dros amser, yn awgrymu mai'r cynhwysydd sydd ar fai: arsugniad ar wydr neu giwvetau, yn enwedig os oedd yr amseroedd cyswllt yn amrywio drwy'r rhediad. Ac mae llinell lân drwy bwyntiau sy'n dal i roi canlyniadau sampl anghywir yn awgrymu mai'r matrics sydd ar fai: mae'r samplau'n wahanol i'r samplau graddnodi, felly ail-luniwch y gromlin ym matrics y sampl neu newidiwch i ychwanegu safon. Plotiwch y gweddillion yn erbyn crynodiad ym mhob achos. Mae gwasgariad ar hap yn cefnogi'r model llinell syth; mae siâp gwên neu wgu yn ei wrthbrofi'n fwy dibynadwy nag unrhyw drothwy R sgwâr, pwynt y mae'r canllawiau dilysu yn ei gefnogi'n benodol.

Mae glas methylen yn gwobrwyo'r ddisgyblaeth hon. Mae ei fand monomer yn gryf, mae ei gemeg wedi'i mapio'n dda, ac mae ei ddulliau methu yn datgelu eu hunain yn y sbectrwm cyn iddynt lygru'r rhifau. Lluniwch y gromlin dros amrediad cul, defnyddiwch sampl wag onest, paratowch ailadroddiadau annibynnol, a gadewch i siâp y sbectra benderfynu ar yr amrediad. Mae'r llinell sy'n deillio o hynny'n fyr, ond mae pob pwynt arni'n wir.

Mae'r cyfrifiadau darluniadol yn yr erthygl hon yn defnyddio rhifau wedi'u dyfeisio i ddangos y dull. Mae cyfernodau cyfeirio wedi'u mesur, gyda'r amodau llawn, yn ymddangos yn y cyfeirnod sbectrol cysylltiedig, ac mae'r astudiaeth agregu sylfaenol wedi'i mynegeio yn PMID 33251415.