Methylenová modř a ATP: znamená vyšší spotřeba kyslíku více energie?

Izolovaná mitochondrie se nachází v komoře s palivem, ale bez ADP. Kyslík spotřebovává pomalu. Přidejte ADP a spotřeba kyslíku několikanásobně vzroste. Počkejte, až se ADP vyčerpá, a spotřeba kyslíku opět klesne. Palivo se nezměnilo. Změnila se pouze potřeba ATP.

Tato krátká posloupnost zachycuje celý rozdíl, kterému se článek věnuje. Spotřeba kyslíku měří, jak rychle elektrony proudí dýchacím řetězcem ke kyslíku. Produkce ATP měří, jak velká část tohoto toku se zachytí jako využitelná energie. Oba procesy mají společný mezikrok: protonový gradient napříč vnitřní mitochondriální membránou. Cokoli, co změní těsnost spřažení tohoto gradientu se syntézou ATP, může oba výsledné ukazatele posunout různými směry. Methylenová modř je zde užitečným názorným příkladem, protože u ní byly pozorovány obě možnosti: v některých preparátech zvyšovala spotřebu kyslíku současně s ATP, zatímco v jiných zvyšovala spotřebu kyslíku, ale ATP zůstávalo beze změny nebo klesalo.

Čtenáři, kteří chtějí nejprve získat širší představu o přenosu elektronů, mohou začít tím, jak methylenová modř přenáší elektrony dýchacím řetězcem. Ti, kteří se chtějí seznámit s terminologií raných experimentů s kyslíkem, si mohou přečíst, co první měření respirace skutečně ukázala.

Respirace, ATP a gradient mezi nimi

Elektrony z NADH a FADH2 vstupují do řetězce v komplexech I a II, procházejí komplexem III k cytochromu c a poté komplexem IV ke kyslíku. Energie uvolněná v komplexech I, III a IV pohání čerpání protonů z matrix do mezimembránového prostoru. Toto oddělení náboje a rozdíl kyselosti vytvářejí protonmotivní sílu. Její elektrická složka, membránový potenciál, obvykle převládá.

ATP syntáza umožňuje protonům proudit zpět do matrix a využívá uvolněnou energii ke spojení ADP a fosfátu do ATP. Posloupnost je tedy následující:

spotřeba kyslíku, potom čerpání protonů, potom gradient, potom syntéza ATP.

Háček je v tom, že protony se mohou vracet i jinými cestami. Jakýkoli návrat, který obchází ATP syntázu, představuje protonový únik. Únik nutí řetězec znovu čerpat tytéž protony, aby udržel stabilní membránový potenciál. To spotřebovává více kyslíku, aniž by vznikalo více ATP. Dostatečně silný únik vede k rozpojení: spotřeba kyslíku roste, zatímco ATP zůstává beze změny nebo klesá, a nevyužitá energie se uvolňuje jako teplo.

Stav 3, stav 4 a respirační kontrolní poměr

Klasická terminologie pochází ze studií izolovaných mitochondrií. Stav 3 je respirace za přítomnosti substrátu a ADP: ATP syntáza snižuje gradient, membránový potenciál klesá, řetězec zrychluje, aby jej obnovil, a spotřeba kyslíku je vysoká, protože vzniká ATP. Stav 4 je respirace po vyčerpání ADP: ATP syntáza nepracuje, gradient roste, vysoký membránový potenciál brání dalšímu čerpání a spotřeba kyslíku klesá na úroveň potřebnou ke kompenzaci úniku.

Respirační kontrolní poměr, tedy stav 3 dělený stavem 4, proto vypovídá o těsnosti spřažení v daném preparátu. Vysoký poměr znamená, že ADP silně řídí respiraci. Klesající poměr při rostoucí respiraci ve stavu 4 znamená, že začíná převládat únik. Právě z tohoto pohledu dávají níže uvedené výsledky s methylenovou modří smysl.

Stojí za to si zapamatovat jeden názorný model. Vysoký membránový potenciál řetězec zpomaluje. Snížení potenciálu jej zrychluje. Řetězec reaguje na to, jak obtížné je čerpání, nikoli přímo na to, zda vzniká ATP.

Když se výsledné ukazatele mění společně

Nejjasnější příklad spřažení pochází z pokusů s izolovanými mitochondriemi z mozku morčat se zablokovanými respiračními komplexy. Při koncentraci methylenové modři od 100 nanomolů do 1 mikromolu na litr vzrostla klidová spotřeba kyslíku při použití glutamátu s malátem, sukcinátu nebo glycerofosfátu jako paliva, zatímco respirace stimulovaná ADP zůstala beze změny. V mitochondriích s toxicky zablokovaným komplexem I nebo komplexem III barvivo mírně zvýšilo produkci ATP, obnovilo membránový potenciál a zlepšilo příjem vápníku. Navrhovaná cesta představuje zkratku: barvivo přijímá elektrony před místem blokády a předává je cytochromu c, čímž obchází poškozený komplex.

Druhý případ společného zvýšení využívá zcela jiný zdroj ATP. V izolovaných mozkových mitochondriích s inhibovanou ATP syntázou methylenová modř stále stimulovala respiraci při všech testovaných substrátech. Syntéza ATP však vzrostla pouze při použití alfa-ketoglutarátu a glutamátu, dvou substrátů, z nichž vzniká sukcinyl CoA. Když oligomycin blokoval ATP syntázu, dodatečné ATP vznikalo substrátovou fosforylací prostřednictvím sukcinyl CoA ligázy v citrátovém cyklu, nikoli oxidativní fosforylací. Barvivo také obnovilo membránový potenciál při současné inhibici komplexu I a ATP syntázy. Spotřeba kyslíku a ATP se zde měnily společně, ale pouze tam, kde substrát umožňoval druhou cestu tvorby ATP. Při použití sukcinátu nebo malátu respirace vzrostla bez dodatečné tvorby ATP. Stejné barvivo, stejná komora, jiné palivo, jiný výsledek.

Když se výsledné ukazatele rozcházejí

Případy, kdy se ukazatele rozcházejí, jsou rovněž publikované a stejně poučné. Ve studii izolovaných mitochondrií z jater potkanů z roku 1997 methylenová modř urychlila respiraci ve stavu 4 v těsně spřažených mitochondriích využívajících sukcinát, což snížilo respirační kontrolní poměr. Účinek byl patrný od 0.5 mikromolu na litr a silný při 5 mikromolech na litr, tedy při koncentraci blízké plazmatickým hladinám po intravenózním bolusu 100 miligramů. Při 5 mikromolech na litr mitochondrie také bobtnaly, ale porucha spřažení se nejprve objevila při nižších koncentracích. To nasvědčuje tomu, že únik předcházel strukturálnímu poškození, nikoli že z něj vyplýval. V rozpojených mitochondriích barvivo stimulovalo respiraci způsobem závislým na koncentraci a vykazujícím saturaci. Spotřeba kyslíku vzrostla v obou preparátech. Syntéza ATP na jednotku spotřebovaného kyslíku nikoli. Jde o učebnicové rozpojení spolu s přenosem elektronů, obojí u téže molekuly.

Nejvýraznější rozchod pochází ze sítnice. U myší s nedostatkem AIF a fotoreceptorových buněk vystavených rotenonu methylenová modř zachovala tloušťku sítnice, markery fotoreceptorů a mitochondriální strukturu, snížila poměr NADH k NAD a utlumila stresové dráhy včetně odpovědi na nesbalené proteiny a mitofagie. To vše bez nápravy nedostatku ATP. Ochrana bez obnovení energie znamená, že přínos vycházel z redoxní rovnováhy a integrity mitochondrií, nikoli z dodatečného ATP. Každý, kdo by ztotožnil přežití tkáně s obnovenou produkcí energie, by tento experiment vyložil zcela nesprávně.

Výzkum mozkových mitochondrií do stejné bilance přidává i náklady. Tytéž nízké koncentrace, které zlepšily bioenergetiku, zároveň za všech testovaných podmínek zvýšily tvorbu peroxidu vodíku a zpomalily jeho odstraňování. To bylo měřeno kalibrovaným testem Amplex, nikoli nespecifickým barvivem. Více ATP a více oxidantu šlo ruku v ruce.

Praktický kontrolní seznam pro čtení studií

Čtyři otázky pomohou odlišit spřažený výsledek od rozpojeného.

Zaprvé, který výsledný ukazatel byl skutečně měřen. Samotná spotřeba kyslíku nemůže vypovídat o ATP. Syntéza ATP, membránový potenciál a respirační kontrolní poměr přidávají každý jednu informaci, kterou kyslíková elektroda nezachytí. Průvodce čtením tvrzení z výzkumu methylenové modři tento důsledný přístup k výsledným ukazatelům podrobně rozebírá.

Zadruhé, který substrát sloužil mitochondriím jako palivo. Výsledek se sukcinyl CoA ukazuje, že volba paliva může rozhodnout, zda se zvýšená respirace vůbec může proměnit v dodatečné ATP.

Zatřetí, jaká koncentrace byla použita. Methylenová modř v nanomolárních až nízkých mikromolárních koncentracích přinesla v mozkových mitochondriích mírné bioenergetické zlepšení za cenu zvýšené tvorby oxidantu; půl mikromolu na litr a více v jaterních mitochondriích oslabovalo spřažení; 5 mikromolů na litr navíc způsobovalo bobtnání. Koncentrace je součástí mechanismu, nikoli okrajovým detailem.

Začtvrté, v jakém modelu byl výsledek získán. Izolované mitochondrie odhalují vnitřní zapojení, ale neporušené buňky a tkáně přidávají transport, redukci na bezbarvou formu a konkurenční cesty odčerpávající elektrony. Laboratorní práce s dávkováním, včetně toho, jak koncentrace a protokol ovlivňují účinky methylenové modři, tvoří most mezi čísly z měřicí komory a jakýmkoli tvrzením o člověku.

Spotřeba kyslíku vypovídá o toku elektronů. ATP vypovídá o tom, jak velká část tohoto toku byla zachycena. Methylenová modř může změnit kterýkoli z těchto ukazatelů a výše uvedené experimenty ukazují všechny čtyři výsledné kombinace: oba rostou, respirace roste pouze tam, kde to substrát umožňuje, respirace roste při klesajícím spřažení a tkáň je zachována, zatímco ATP zůstává beze změny. Číslo na kyslíkové elektrodě je začátkem interpretace, nikoli jejím koncem.