Methylenová modř a Bartonella: laboratorní nálezy a meze klinických důkazů

Kultivační miska a pacient mají společné slovo, infekce, ale ne jeho význam. V misce je infekce počtem kolonií na agaru. U pacienta jde o bakterie uvnitř buněk a cév, léčiva procházející krví a tkáněmi a imunitní systém, který odvádí část práce. Zaměníme-li tyto dvě situace, začne působivý laboratorní údaj vypadat jako léčebný postup. Když je oddělíme, zůstane tentýž údaj tím, čím skutečně je: důvodem k dalšímu experimentu.

Právě toto rozlišení je hlavním úkolem tohoto přehledu o methylenové modři a bakterii Bartonella. Dvě laboratorní studie jedné výzkumné skupiny testovaly methylenovou modř proti Bartonella henselae v nerostoucím stavu. Obě zaznamenaly silnou aktivitu ve skleněných a plastových nádobách. Ani jedna ji netestovala u člověka.

Proč výzkumníci testují stacionární fázi

Většina testů antibiotik používá rostoucí buňky. Tento model však opomíjí obtížnější případ: buňky, které se přestaly dělit a tolerují léčiva usmrcující jejich rostoucí protějšky.

Bartonella může v těle přetrvávat, mimo jiné uvnitř erytrocytů a endoteliálních buněk. Skupina proto zkoumala, která schválená léčiva dokážou usmrtit B. henselae po přechodu do stacionární fáze. Nízká MIC u rostoucích buněk nepředpovídala usmrcování ve stacionární fázi. Rifampicin měl velmi nízkou MIC, přesto stacionární buňky usmrcoval jen slabě, zatímco látky s vyššími hodnotami MIC je usmrcovaly dobře. Čtenáři, kteří hledají obecný postup pro čtení tohoto typu publikací, jej najdou v průvodci čtením výzkumu methylenové modři.

První screening: Li a kolegové, 2019

Screening stacionární fáze z roku 2019 v časopise Antibiotics používal jediný kmen, B. henselae JK53, pěstovaný ve Schneiderově médiu s 10 procenty fetálního bovinního séra při 37 C a 5 procentech CO2. Jednodenní kultury tvořily převážně rozptýlené dělící se buňky. Pětidenní kultury s přibližně 10 na 8. mocninu jednotek tvořících kolonie na mL byly považovány za stacionární fázi a obsahovaly viditelné agregáty.

Test využíval SYBR Green I s propidium jodidem a byl kalibrován pomocí směsí živých buněk a buněk usmrcených isopropanolem. Protože je methylenová modř výrazně zbarvená, pozitivní nálezy byly ověřeny mikroskopicky a následně počítáním kolonií na krevním agaru, což představovalo přísnější hodnoticí kritérium.

Ze souboru 1,581 schválených léčiv při koncentraci 50 mikromolů na litr ponechala methylenová modř 16 procent životaschopných buněk podle čtečky mikrotitračních destiček a 25 procent podle mikroskopie. U daptomycinu to bylo 21 procent, u několika azolů 22 až 27 procent, u gentamicinu 32 procent, u erythromycinu 66 procent a u ciprofloxacinu 74 procent. Pyrvinium-pamoát vykazoval podle čtečky silnější účinek, ale kvůli vlastní fluorescenci jej nebylo možné vyhodnotit mikroskopicky.

U rostoucí B. henselae byla MIC methylenové modři 0.08 až 0.16 mikrogramů na mL. U pětidenních stacionárních buněk při koncentraci 5 mikrogramů na mL klesl počet kolonií po jednom dni expozice pod mez detekce, stejně jako u daptomycinu a pyrvinium-pamoátu při jejich testovaných koncentracích. Samostatný experiment sledující usmrcování v čase používal 10 mikrogramů na mL. Jde o laboratorní úrovně expozice, nikoli dávky, a publikace je takto uvádí. Citovaná maximální plazmatická koncentrace u člověka kolem 3.9 mikrogramů na mL se v publikaci objevuje pouze jako kontext. Přehled farmakokinetiky methylenové modři vysvětluje, proč nelze plazmatickou koncentraci chápat jako koncentraci v tkáni.

Publikace výslovně uvádí dvě omezení. Neobsahovala model biofilmu ani testování kombinací s methylenovou modří. Pětidenní agregáty byly shluky ve stacionární tekuté kultuře, nikoli validovaný experiment s biofilmem. Autoři vyzvali k výzkumu na zvířatech, ke studiu kombinací a biofilmu a k testování u dalších druhů rodu Bartonella.

Kombinace a buňky získané z biofilmu: Zheng a kolegové, 2020

Navazující studie z roku 2020 v časopise BMC Microbiology zachovala stejný kmen i médium, ale přešla na šestidenní stacionární kultury a doplnila dvě věci, které v první publikaci chyběly: kombinace dvou léčiv a model buněk získaných z biofilmu.

Při testování jednotlivých léčiv v jednotné koncentraci 5 mikrogramů na mL po dobu 24 hodin zůstalo po methylenové modři 3.2 krát 10 na 4. mocninu jednotek tvořících kolonie na mL, oproti přibližně 2.8 krát 10 na 10. mocninu v kontrolní kultuře. Po ciprofloxacinu, gentamicinu a nitrofurantoinu zůstalo ve stejném časovém bodě méně kolonií. To se liší od výsledku z roku 2019, kdy při stejné nominální koncentraci nebyly po jednom dni detekovány žádné kolonie. Stáří kultury, její hustota i způsob zpracování se lišily, takže usmrcování bylo reprodukovatelné co do směru účinku, nikoli však totožné co do jeho rozsahu. Tento posun mezi experimenty je jedním z důvodů, proč standardní kontroly bezpečnosti a interakcí posuzují laboratorní účinnost odděleně od klinického účinku.

Nejčastěji citovanou částí je screening kombinací. Každá složka měla pevně stanovenou koncentraci 5 mikrogramů na mL. Jak azithromycin s methylenovou modří, tak rifampicin s methylenovou modří vedly po 24 hodinách k nulovému počtu detekovatelných kolonií ve stacionární fázi, stejně jako obě dvojice s ciprofloxacinem. Ze 25 testovaných dvojic to dokázaly pouze tyto čtyři. Formální analýza synergie nebyla provedena, proto je správné označení aktivní kombinace za těchto podmínek, nikoli prokázaná synergie.

Experiment s biofilmem testoval buňky získané z mladého narušeného biofilmu, nikoli pronikání do neporušeného zralého biofilmu. Kultury byly pěstovány pět dní, poté naředěny do destiček s jamkami na dalších pět dní, ověřeny barvením krystalovou violetí a před expozicí léčivům seškrábnuty. Při koncentraci 5 mikrogramů na mL klesl počet po samotné methylenové modři do dne 6 na 2.3 krát 10 na 2. mocninu, což patřilo k nejlepším výsledkům jednotlivých látek, ale nebyla to nula. Obě kombinace s methylenovou modří dosáhly do dne 6 nuly, stejně jako obě kombinace s ciprofloxacinem.

Autoři upozornili na stejná omezení, kterých by si všiml pozorný čtenář: mladý seškrábnutý biofilm namísto starého neporušeného biofilmu, jedna prakticky zvolená koncentrace pro všechna léčiva namísto realistické maximální koncentrace každého z nich, pouze vybrané dvojice založené na azithromycinu nebo rifampicinu, jeden kmen, žádná zvířata, žádní pacienti. Pozdější výzkum kombinací tří léčiv byl navržen, nikoli popsán jako provedený.

Srovnání uspořádání studií

Tabulka shrnuje hlavní sdělení tohoto článku. Vše nalevo od posledního sloupce je práce s kulturami. Nic z obou publikací nespadá do posledního sloupce.

Bartonella není Borrelia

Obě publikace zmiňují Borrelia burgdorferi, spirochétu způsobující lymskou boreliózu, protože test s barvivy vycházel z dřívějšího výzkumu stacionární fáze borrelií v téže laboratoři, kde methylenová modř a daptomycin rovněž vykazovaly aktivitu. Tato historie poskytuje užitečný kontext, ale je také častým zdrojem omylů.

Žádný experiment v obou publikacích o bakterii Bartonella netestuje borrelie souběžně s bartonellami. Organismy se liší, média se liší, koncentrace se liší a předpokládaný účinek methylenové modři na membránu bartonell byl označen za spekulaci vyžadující další výzkum. Výsledky by se neměly přenášet mezi druhy a ani jedna publikace nepodporuje obecná tvrzení o parazitech. Srovnání perzisterů borrelií a bartonell proto tyto dva soubory literatury odděluje.

Proč se výsledky kultivací nedají převést na protokol

Zájem o vyhledávání protokolu s methylenovou modří pro bartonelly je pochopitelný. Tyto publikace ukazují, proč by taková fráze měla být spíše varovným signálem než nákupním seznamem.

Zaprvé, 5 mikrogramů na mL v jamce není lékařský předpis. Tento údaj nezahrnuje vstřebávání, distribuci, vazbu na bílkoviny, průnik do buněk ani snášenlivost. Autoři jej zvolili jako hrubý průměr maximálních koncentrací antibiotik a uvedli, že budoucí výzkum by měl každé léčivo používat při jeho vlastní realistické koncentraci.

Zadruhé, nula kolonií znamená žádné kolonie za daných podmínek kultivace na agaru, nikoli sterilní tkáň. Perzistery, intracelulární bakterie i omezení odběru vzorků zůstávají mimo to, co agarová plotna zachycuje.

Zatřetí, kombinace, které sterilizují obsah jamky, mohou v těle selhat nebo škodit. Azithromycin s methylenovou modří a rifampicin s methylenovou modří jsou laboratorní dvojice při laboratorních expozicích. Bez farmakokinetických studií na zvířatech a kontrolovaných údajů u lidí není stanovena dávka, délka podávání ani poměr přínosů a rizik. Každý, kdo zvažuje možnosti, by je měl probrat s lékařem a seznámit se s tím, kdy použití methylenové modři vyžaduje lékařský dohled, než z údajů z kultivačních misek vyvodí jakýkoli závěr.

Úzký závěr, který tyto publikace skutečně podporují, zní takto: methylenová modř má reprodukovatelnou aktivitu proti nerostoucí B. henselae JK53 in vitro, včetně laboratorních kombinací dvou léčiv, přičemž nejsilnější výsledky kombinací a buněk získaných z biofilmu pocházejí ze studie z roku 2020. Vše ostatní, včetně toho, zda je tato aktivita významná pro bartonelózu u člověka, zůstává neověřeno.