Absorpční spektrum methylenové modři a molární absorpční koeficient: přehled s uvedenými podmínkami

Spektrum methylenové modři vypadá jednoduše, dokud se nepokusíte převzít některou z jeho číselných hodnot. Jedna laboratoř uvádí molární extinkční koeficient přibližně 82,000. Jiná uvádí 67,000. Třetí uvádí více než 100,000. Všechny tři hodnoty mohou správně popisovat příslušná měření, ale žádná z nich není univerzální konstantou tohoto barviva.

Nejasnosti vznikají směšováním dvou odlišných pojmů. Absorbance je výsledek měření konkrétního roztoku v konkrétní kyvetě. Molární absorpční koeficient, často označovaný jako epsilon, je parametr modelu tohoto roztoku. Když se změní stav asociace methylenové modři, změní se model, a tedy i tento parametr. Je užitečné zacházet s každým koeficientem jako s hodnotou doplněnou o podmínky: spolu s číslem vždy uvádět vlnovou délku, rozpouštědlo, pH nebo pufr, teplotu, koncentrační rozsah a délku optické dráhy.

Pás monomeru ve zředěném vodném roztoku

Ve zředěném vodném roztoku leží dominantní pás kationtu methylenové modři poblíž 664 až 665 nm; v závislosti na přístroji a zvolené kalibraci se běžně uvádí rozmezí 664 až 668 nm. Tento pás je vhodný pro kvantifikaci, pokud je roztok dostatečně zředěný, aby většina barviva byla v monomerní formě.

Tři hodnoty z literatury ukazují, proč jsou podmínky důležitější než samotné číslo. Výzkumníci zabývající se jíly, kteří udržovali koncentraci vodných vzorků pod přibližně 7 mikromolární hodnotou a používali kyvety o délce 1 cm, uváděli epsilon přibližně 82,000 M-1 cm-1 při 665 nm. Tato hodnota je neobvykle dobře doložena jako empirická směrnice kalibrace velmi zředěných vodných vzorků. Pozdější primární kalibrace v deionizované vodě, provedená v rozsahu 2.34 až 37.52 mikromolární koncentrace a s optickou dráhou 1 cm, poskytla hodnotu přibližně 67,100 M-1 cm-1 při 665 nm pro celkové barvivo. Nižší výsledek je očekávaný, nikoli rozporný, protože horní polovina tohoto kalibračního rozsahu již obsahuje nezanedbatelné množství dimeru. Třetí hodnota, přibližně 73,460 M-1 cm-1 při 664 nm, pochází z práce při pH 6.86 a 293 K, která rozložila pozorované spektrum na monomerní a dimerní složku, jak shrnuje nedávný kritický přehled fotofyziky methylenové modři. Toto číslo představuje dekonvolucí získanou monomerní složku, nikoli přímou směrnici závislosti absorbance na celkové koncentraci barviva.

Praktický závěr: vyberte koeficient, jehož podmínky odpovídají vašim vzorkům, nebo proveďte vlastní kalibraci. Nepřebírejte hodnotu 82,000 do stanovení ve fosfátovém pufru při 30 mikromolární koncentraci s předpokladem, že linearita stále platí.

Rameno při kratších vlnových délkách je směsí příspěvků

S rostoucí koncentrací se rameno poblíž 600 až 615 nm zvětšuje vůči maximu při 664 nm. Současné práce obvykle umisťují příspěvek dimeru typu H poblíž 605 až 610 nm. Globální spektrální analýza methylenové modři ve vodě rozlišuje maximum dimeru při 607 nm a maximum vyššího agregátu při 600 nm, přičemž rezonanční složky monomeru leží při 664 a 650 nm. Úplný text je dostupný prostřednictvím volně přístupného záznamu pro PMID 33251415.

Toto rameno by se nemělo označovat za čistou absorbanci dimeru. Ve stejné oblasti přispívá také vibronická struktura monomeru, takže naměřená výška je superpozicí příspěvků. Při jednom globálním proložení se ukázalo, že model zahrnující monomer a dimer nevyhovuje v celém rozsahu od 1.1 mikromolární do 3.4 milimolární koncentrace, zatímco přidání tetrameru poskytlo nejlepší shodu; signál tetrameru byl přitom detekovatelný již pod 34 mikromolární koncentrací. Koeficienty získané pro jednotlivé složky byly vysoké: přibližně 107,800 M-1 cm-1 při 664 nm pro hlavní monomerní složku, přibližně 101,400 pro dimer při 607 nm a přibližně 138,500 pro tetramer při 600 nm, a to v nepufrované deionizované vodě s chloridem sodným v rozsahu 0 až 0.15 M a při teplotách 282 až 333 K. Jde o složky rozlišené modelem, a proto jimi nelze nahrazovat empirickou směrnici podle Beerova–Lambertova zákona.

Míra dimerizace byla stanovena i přímo. Při pH 6.86 a 293 K získala jedna studie dimerizační konstantu přibližně 3,900 M-1. Její velikost vysvětluje, proč se pracovní roztok s 5 mikromolární koncentrací chová téměř lineárně, zatímco zásobní roztok s 50 mikromolární koncentrací nikoli. Užitečnou kontrolou při vývoji metody je poměr absorbance poblíž 610 nm k absorbanci poblíž 665 nm. Pokud tento poměr s koncentrací roste, epsilon při 664 nm již nepopisuje jednu neměnnou chemickou formu.

V koncentračním intervalu, kde dominuje jedna dvojice vzájemně se přeměňujících forem, mohou mít spektra společný isosbestický bod, který se ve vodných koncentračních řadách experimentálně nachází poblíž 625 nm. Zřetelný stacionární bod odpovídá přítomnosti dvou dominantních forem. Pokud se bod s rostoucí koncentrací posouvá nebo mizí, berte to jako upozornění na vznik vyšších agregátů nebo posun rovnováh, nikoli jako chybu přístroje.

Rozpouštědlo, pH a teplota mění spektrum

Voda podporuje asociaci. Přidání dimethylsulfoxidu potlačuje dimerizaci, posouvá absorpční a fluorescenční maxima k delším vlnovým délkám a zvyšuje kvantový výtěžek fluorescence přibližně čtyřnásobně, jak uvádí studie vlivu rozpouštědla na methylenovou modř ve směsích vody a DMSO, indexovaná jako PMID 30933781. Tato práce popisuje vodná spektra jako rovnováhu monomeru a dimeru s absorbancí monomeru poblíž 650 až 670 nm a absorbancí dimeru poblíž 580 až 615 nm a ze spekter při 293.15 K odvozuje dimerizační konstanty.

Alkoholy mění polohu i zdánlivou intenzitu pásu, ale agregaci neodstraňují. V jednom primárním porovnání při 31.3 mikromolární koncentraci a pokojové teplotě, popsaném ve studii vlivu rozpouštědla na methylenovou modř, leželo dlouhovlnné maximum při 665 nm ve vodě, ale při 655 nm v methanolu; zdánlivé koeficienty pro celý roztok byly přibližně 37,100 ve vodě a 60,800 v methanolu. Samostatná validace v absolutním ethanolu při 298 K poskytla maximum při 655 nm s epsilon přibližně 68,000.

Běžné změny pH posouvají spektrum méně, než předpokládá mnoho protokolů. Výše citovaný kritický přehled uvádí, že přibližně od pH 2 do pH 12 zůstávalo maximum poblíž 665 nm a až do pH 11 docházelo jen k malým změnám intenzity. Druh pufru a iontová síla mohou výsledky ovlivnit stejně výrazně jako nominální pH, proto zaznamenávejte skutečně použitý pufr a sůl, nejen údaj z pH metru. Silně kyselé nebo silně zásadité prostředí je samostatný případ, protože barvivo může podléhat chemické změně namísto reverzibilní asociace. Rovnováhu posouvají také teplota a sůl, a proto studie ve vodě z roku 2020 obě tyto veličiny cíleně měnila.

Jak měřit, aby hodnota zůstala platná

Kvantitativní práce stojí na Beerově–Lambertově vztahu, podle něhož se absorbance rovná součinu epsilon, koncentrace a délky optické dráhy, a na důkazu, že lineární interval za vašich podmínek skutečně platí.

Pro práci s nízkými mikromolárními koncentracemi používejte kyvetu o délce 1 cm. Při epsilon přibližně 82,000 dává 5 mikromolární koncentrace absorbanci přibližně 0.41 a 10 mikromolární koncentrace přibližně 0.82. Pro měření zaměřené na monomer v samotné vodě je bezpečnější zůstat přibližně na 5 až 7 mikromolární koncentraci nebo níže než kalibrovat hluboko v oblasti desítek mikromolární koncentrace. U koncentrovaných zásobních roztoků zkraťte optickou dráhu, místo abyste přijímali absorbanci výrazně nad 1.

Jako slepý vzorek použijte totožnou matrici: stejnou kvalitu vody, stejný podíl kosolventu, stejný pufr a soli, ale bez barviva. Kalibrační roztoky připravujte ve stejné matrici a při stejné teplotě. Během vývoje metody skenujte celý viditelný rozsah, ideálně přibližně 550 až 750 nm, místo odečtu na jediné vlnové délce. Sledujte tvar, nejen výšku. Pokud se při postupném ředění mění normalizovaný tvar, je systém z chemického hlediska závislý na koncentraci. Stabilní maximum a stabilní poměr absorbancí při 610 a 665 nm jsou silnějším důkazem přijatelného rozsahu než samotné vysoké R na druhou.

Zdokumentujte formu činidla. Komerční materiál může být bezvodý methylthioniniumchlorid nebo hydrát, například trihydrát, takže molární hmotnost použitá k výpočtům zásobního roztoku musí odpovídat skutečnému obsahu lahve. Už tento krok vysvětluje část rozdílů mezi nominálními molárními koncentracemi v různých laboratořích. Stejná důslednost je potřebná, když výsledky vstupují do výpočtů kvantitativního stanovení, když spektra slouží ke kontrolám stability formulací a když profily nečistot vyžadují posouzení čistoty a specifikací.

Souhrn s uvedenými podmínkami

Tuto tabulku používejte jako výchozí šablonu laboratorního záznamu, nikoli jako zdroj vzájemně zaměnitelných konstant.

Odpověď na otázku absorpční vlnové délky methylenové modři je tedy krátká, ale vyžaduje dlouhou poznámku. Uvádějte maximum, které jste naměřili, v roztoku, který jste měřili, při koncentraci, při níž jste měřili. Tento návyk zabrání tomu, aby se jedna hodnota poblíž 664 nm pro zředěný vodný roztok proměnila ve falešnou univerzální konstantu.