Znači li veća potrošnja kisika više ATP-a? Pouke iz istraživanja metilenskog plavila

Izolirani mitohondrij nalazi se u komori s gorivom, ali bez ADP-a. Sporo troši kisik. Dodavanjem ADP-a potrošnja kisika raste nekoliko puta. Kada se ADP potroši, potrošnja kisika ponovo opada. Gorivo se nije promijenilo. Promijenila se samo potreba za ATP-om.

Taj kratki slijed sadrži cijelu razliku kojom se ovaj članak bavi. Potrošnja kisika mjeri brzinu protoka elektrona kroz respiratorni lanac do kisika. Proizvodnja ATP-a mjeri koliko se tog protoka pretvara u iskoristivu energiju. Ta dva procesa dijele međukorak, protonski gradijent preko unutrašnje mitohondrijske membrane, a sve što mijenja čvrstoću sprezanja tog gradijenta sa sintezom ATP-a može promijeniti ta dva krajnja pokazatelja u različitim smjerovima. Metilensko plavilo ovdje je poučan primjer jer je zabilježeno da djeluje na oba načina: u nekim preparatima povećava potrošnju kisika zajedno s ATP-om, a u drugima povećava potrošnju kisika dok ATP ostaje nepromijenjen ili opada.

Čitaoci koji prvo žele širu sliku prijenosa mogu početi od objašnjenja kako metilensko plavilo prenosi elektrone kroz respiratorni lanac, a oni koji žele upoznati terminologiju ranih eksperimenata s kisikom mogu pročitati šta su prva mjerenja respiracije zapravo pokazala.

Respiracija, ATP i gradijent između njih

Elektroni iz NADH i FADH2 ulaze u lanac na kompleksima I i II, prolaze kroz kompleks III do citohroma c, a zatim kroz kompleks IV do kisika. Energija oslobođena na kompleksima I, III i IV pokreće ispumpavanje protona iz matriksa u međumembranski prostor. To razdvajanje naboja i kiselosti stvara protonsku pokretačku silu, a njen električni dio, membranski potencijal, obično je dominantan.

ATP sintaza omogućava protonima da se vrate u matriks i koristi oslobođenu energiju za spajanje ADP-a i fosfata u ATP. Dakle, slijed je:

potrošnja kisika, zatim ispumpavanje protona, zatim gradijent, zatim sinteza ATP-a.

Problem je u tome što se protoni mogu vratiti i drugim putevima. Svaki povratak koji zaobilazi ATP sintazu predstavlja curenje protona. Curenje prisiljava lanac da ponovo ispumpava iste protone kako bi održao stabilan membranski potencijal, što troši više kisika bez stvaranja dodatnog ATP-a. Dovoljno snažno curenje predstavlja rasprezanje: potrošnja kisika raste dok ATP ostaje nepromijenjen ili opada, a neiskorištena energija oslobađa se kao toplota.

Stanje 3, stanje 4 i omjer respiratorne kontrole

Klasična terminologija za ove procese potiče iz istraživanja izoliranih mitohondrija. Stanje 3 označava respiraciju u prisustvu supstrata i ADP-a: ATP sintaza smanjuje gradijent, membranski potencijal opada, lanac ubrzava kako bi ga obnovio, a potrošnja kisika je visoka jer se stvara ATP. Stanje 4 označava respiraciju nakon što se ADP potroši: ATP sintaza miruje, gradijent raste, visoki membranski potencijal otežava daljnje ispumpavanje, a potrošnja kisika opada na nivo potreban za nadoknađivanje curenja.

Omjer respiratorne kontrole, stanje 3 podijeljeno stanjem 4, zato pokazuje koliko je preparat čvrsto spregnut. Visok omjer znači da ADP snažno kontrolira respiraciju. Pad omjera uz porast respiracije u stanju 4 znači da curenje preuzima glavnu ulogu. Kroz ovu prizmu postaju razumljivi rezultati istraživanja metilenskog plavila navedeni u nastavku.

Vrijedi zadržati jedan mentalni model. Visoki membranski potencijal usporava lanac. Rasipanje potencijala ubrzava ga. Lanac reagira na to koliko je ispumpavanje postalo teško, a ne direktno na to stvara li se ATP.

Kada se krajnji pokazatelji mijenjaju zajedno

Najjasniji primjer spregnutog djelovanja potiče iz istraživanja izoliranih mitohondrija mozga zamorca s blokiranim respiratornim kompleksima. Pri koncentracijama metilenskog plavila od 100 nanomolara do 1 mikromolara, potrošnja kisika u mirovanju rasla je uz glutamat i malat, sukcinat ili glicerofosfat kao gorivo, dok je respiracija stimulirana ADP-om ostala nepromijenjena. U mitohondrijima u kojima je otrovom blokiran kompleks I ili kompleks III, boja je umjereno povećala proizvodnju ATP-a, obnovila membranski potencijal i poboljšala unos kalcija. Predloženi put predstavlja prečicu: boja prihvata elektrone prije mjesta blokade i predaje ih citohromu c, zaobilazeći oštećeni kompleks.

Drugi slučaj zajedničkog porasta koristi potpuno drugačiji izvor ATP-a. U izoliranim mitohondrijima mozga s inhibiranom ATP sintazom, metilensko plavilo i dalje je stimuliralo respiraciju na svakom ispitanom supstratu. Međutim, sinteza ATP-a rasla je samo na alfa-ketoglutaratu i glutamatu, dvama supstratima iz kojih nastaje sukcinil-CoA. Kada je oligomicin blokirao ATP sintazu, dodatni ATP nastajao je fosforilacijom na nivou supstrata putem sukcinil-CoA ligaze u ciklusu limunske kiseline, a ne oksidativnom fosforilacijom. Boja je također obnovila membranski potencijal kada su kompleks I i ATP sintaza bili istovremeno inhibirani. Ovdje su potrošnja kisika i ATP rasli zajedno, ali samo kada je supstrat omogućavao drugi put stvaranja ATP-a. Na sukcinatu ili malatu respiracija je rasla bez dodatnog ATP-a. Ista boja, ista komora, drugačije gorivo, drugačiji odgovor.

Kada se krajnji pokazatelji razilaze

Slučajevi razilaženja također su objavljeni i jednako su poučni. U istraživanju izoliranih mitohondrija jetre štakora iz 1997. godine, metilensko plavilo ubrzalo je respiraciju u stanju 4 u čvrsto spregnutim mitohondrijima koji su koristili sukcinat, čime je smanjilo omjer respiratorne kontrole. Učinak je bio vidljiv od 0.5 mikromolara, a snažan pri 5 mikromolara, koncentraciji bliskoj nivoima u plazmi nakon intravenskog bolusa od 100 miligrama. Pri 5 mikromolara mitohondriji su također nabubrili, iako se poremećaj sprezanja prvo pojavio pri nižim koncentracijama, što upućuje na to da je curenje prethodilo strukturnom oštećenju, umjesto da je nastalo zbog njega. U raspreženim mitohondrijima boja je stimulirala respiraciju na način koji je zavisio od koncentracije i dostizao zasićenje. Potrošnja kisika rasla je u oba preparata. Sinteza ATP-a po jedinici potrošenog kisika nije. To je školski primjer rasprezanja i prijenosa elektrona u istoj molekuli.

Najupečatljivije razilaženje zabilježeno je u mrežnici. Kod miševa s nedostatkom AIF-a i fotoreceptorskih ćelija tretiranih rotenonom, metilensko plavilo očuvalo je debljinu mrežnice, fotoreceptorske markere i mitohondrijsku strukturu, snizilo omjer NADH prema NAD i ublažilo aktivnost puteva odgovora na stres, uključujući odgovor na nesavijene proteine i mitofagiju. To je postiglo bez ispravljanja manjka ATP-a. Zaštita bez obnove energije znači da je korist ostvarena putem redoks ravnoteže i integriteta mitohondrija, a ne putem dodatnog ATP-a. Svako ko bi očuvanje tkiva izjednačio s obnovljenom proizvodnjom energije potpuno bi pogrešno protumačio taj eksperiment.

Istraživanja mitohondrija mozga istoj slici dodaju i cijenu. Iste niske koncentracije koje su poboljšale bioenergetiku također su povećale stvaranje vodikovog peroksida u svim ispitanim uslovima i usporile njegovo uklanjanje, mjereno kalibriranim Amplex testom, a ne nespecifičnom bojom. Više ATP-a i više oksidansa pojavili su se zajedno.

Praktična kontrolna lista za čitanje

Četiri pitanja razlikuju spregnuti rezultat od raspreženog.

Prvo, koji je krajnji pokazatelj zapravo mjeren. Sama potrošnja kisika ne može pokazati količinu ATP-a. Sinteza ATP-a, membranski potencijal i omjer respiratorne kontrole dodaju po jedan dio slike koji kisikova elektroda ne može pokazati. Vodič za čitanje tvrdnji iz istraživanja metilenskog plavila detaljno objašnjava ovaj pristup krajnjim pokazateljima.

Drugo, koji je supstrat hranio mitohondrije. Rezultat sa sukcinil-CoA pokazuje da izbor goriva može odrediti može li se dodatna respiracija uopće pretvoriti u dodatni ATP.

Treće, koja je koncentracija korištena. Metilensko plavilo u nanomolarnim do niskim mikromolarnim koncentracijama u mitohondrijima mozga donijelo je umjerena bioenergetska poboljšanja uz cijenu povećanog stvaranja oksidansa; pola mikromolara i više u mitohondrijima jetre oslabilo je sprezanje; 5 mikromolara dodatno je izazvalo bubrenje. Koncentracija je dio mehanizma, a ne usputni detalj.

Četvrto, u kojem je modelu rezultat dobijen. Izolirani mitohondriji otkrivaju veze među procesima, ali u cijelim ćelijama i tkivima dodatno djeluju transport, redukcija u bezbojni oblik i konkurentski putevi koji preuzimaju elektrone. Laboratorijska istraživanja doziranja, uključujući način na koji koncentracija i protokol oblikuju učinke metilenskog plavila, predstavljaju vezu između brojki iz komore i bilo kakve tvrdnje o čovjeku.

Potrošnja kisika pokazuje tok elektrona. ATP pokazuje koliko je tog protoka pretvoreno u iskoristivu energiju. Metilensko plavilo može promijeniti bilo koji od ta dva pokazatelja, a navedeni eksperimenti pokazuju sve četiri kombinacije koje iz toga slijede: oba rastu, respiracija raste samo tamo gdje to supstrat omogućava, respiracija raste dok sprezanje slabi i tkivo je očuvano dok ATP ostaje nepromijenjen. Broj na kisikovoj elektrodi početak je tumačenja, a ne njegov kraj.