Metilensko plavilo u istraživanjima moždanog udara i cerebralne hipoperfuzije: šta tri modela zapravo pokazuju

Začepljena arterija, ćelijska kultura kojoj nedostaju hranjive tvari i štakor sa suženim vratnim arterijama zvuče kao tri verzije istog eksperimenta. Nisu. Svaki postavlja drugačije pitanje, a metilensko plavilo u svakom daje drugačiji odgovor. Ako ih pomiješate, literatura djeluje proturječno. Ako ih razdvojite, pojavljuje se jasan obrazac kojim uglavnom upravlja vrijeme primjene.

Upravo je to razdvajanje svrha ovog pregleda. Tri modela obuhvataju akutni žarišni moždani udar, uskraćivanje kisika i glukoze uz ponovnu oksigenaciju ćelija u kulturi te hroničnu cerebralnu hipoperfuziju tokom više sedmica. Predloženi mehanizam koji ih povezuje odnosi se na mitohondrije, ali ishodi se razlikuju jer se razlikuju metaboličke okolnosti.

Tri modela odgovaraju na različita pitanja

Akutni žarišni moždani udar kod štakora obično se izaziva okluzijom srednje moždane arterije, skraćeno MCAO. Začepljenje nalik ugrušku stvara ishemijsku jezgru okruženu penumbrom, tkivom koje je ugroženo, ali se potencijalno može spasiti ako se protok obnovi. Pitanje je može li intervencija usporiti širenje infarkta ili očuvati funkciju u periodu oko reperfuzije.

Uskraćivanje kisika i glukoze, skraćeno OGD, odvija se na sasvim drugom nivou. Moždane ćelije u kulturi stavljaju se u uslove s gotovo nimalo kisika i bez glukoze, a zatim se vraćaju u normalan medij. Nema ugruška, kolateralne cirkulacije, krvnog pritiska ni imunološkog sistema. Pitanje je isključivo ćelijsko: šta se događa s ćelijskim disanjem, ATP-om i preživljavanjem kada supstrati nestanu, a zatim se ponovo pojave.

Za hroničnu cerebralnu hipoperfuziju koristi se trajna obostrana okluzija karotidnih arterija kod štakora, nazvana modelom 2VO. Protok krvi u prednji mozak opada i ostaje nizak sedmicama. Nema iznenadnog žarišnog infarkta ni hitne reperfuzije. Pitanje je može li višesedmična metabolička podrška očuvati krvne sudove, mitohondrije i pamćenje tokom dugotrajnog smanjenog protoka.

Poboljšanje pamćenja nakon jednog mjeseca tretmana u modelu 2VO stoga ne govori ništa direktno o spašavanju ljudskog mozga tokom hitne trombektomije. Ta je razlika važna jer je većina optimističnih sažetaka preskače.

Akutni moždani udar: zaštita pri reperfuziji, odgađanje bez nje

Najjasniji akutni rezultat dolazi iz prolazne MCAO s reperfuzijom. Kod štakora je okluzija trajala 60 minuta, nakon čega su intravenozno primili malu dozu metilenskog plavila počevši od reperfuzije, uz dodatne doze nakon 3 sata i 2. dana. MRI je pokazao da se do 2. dana lezija u grupi koja je primala nosač povećala za oko 19 posto, dok se u tretiranoj grupi smanjila za oko 17 posto, uz približno 30 posto manje konačne infarkte i bolje neurološke rezultate 2. i 7. dana. Snimci su pokazali bolje preživljavanje tkiva i u jezgri i u penumbri. Šira literatura o neuroprotekciji ovu zaštitu vezanu za vrijeme reperfuzije razmatra uz nalaze o globalnoj ishemiji i traumi.

Slika se mijenja kada arterija ostane začepljena. U eksperimentu s trajnom MCAO, metilensko plavilo primijenjeno tokom trajanja ishemije usporilo je širenje lezije na difuzijskim snimcima i nakratko produžilo nesklad između perfuzijskih i difuzijskih nalaza, uz nešto bolji lokalni protok, ali konačni volumen infarkta nakon 24 sata nije se značajno razlikovao. Odgodilo je prelazak ugroženog tkiva u infarkt, ali nije zamijenilo ponovno otvaranje krvnog suda.

Treća akutna studija daje dodatni uvid u mehanizam i razlike među dozama. Jedna intraperitonealna doza neposredno nakon okluzije pokazala je najveće smanjenje infarkta, oko 50 posto, pri srednjoj dozi od 5 mg/kg, a ne pri 1 ili 10 mg/kg, uz bolje senzomotoričke rezultate. Autori su to povezali s očuvanom strukturom mitohondrija i pojačanom mitofagijom, selektivnim uklanjanjem oštećenih mitohondrija. Doza, put i raspored primjene stoga su važni, a vrijednosti u mg/kg kod štakora nisu doze za moždani udar kod ljudi.

Ćelijska kultura: ista supstanca pomaže ili šteti zavisno od vremena primjene

Eksperiment s astrocitima najpoučniji je i najčešće pogrešno citiran. Primarni kortikalni astrociti miša bili su izloženi 6 sati teškog uskraćivanja pri 0.1 posto kisika u mediju bez glukoze, piruvata ili seruma, nakon čega je slijedilo 24 sata ponovne oksigenacije uz obnovljenu dostupnost supstrata. Oko polovine ćelija je umrlo, što omogućava da se u testu uoči učinak u oba smjera.

Kada je metilensko plavilo bilo prisutno tokom faze uskraćivanja, preživljavanje se pogoršalo, umjesto da se poboljša. Kada je uvedeno tek pri ponovnoj oksigenaciji, niske mikromolarne koncentracije poboljšale su vijabilnost i povećale potrošnju kisika, unos glukoze i proizvodnju ATP-a. U normalnim uslovima iste koncentracije povećale su unos glukoze za približno 89 posto pri 0.1 mikromolar i oko 200 posto pri 1 mikromolar, uz očuvan glikogen i aktivnost heksokinaze nakon oštećenja te bez izmjerenog porasta superoksida.

Mehanizam je lakše shvatiti poređenjem s rezervnim generatorom. Metilensko plavilo djeluje kao alternativni prenosilac elektrona koji prihvata redukcijske ekvivalente i prenosi ih prema citohromu c i kompleksu IV, čime podržava tok elektrona i sintezu ATP-a, a istovremeno smanjuje curenje elektrona iz prethodnih dijelova lanca. Tokom teškog uskraćivanja ta stimulacija predstavlja nedostatak jer povećava metaboličke potrebe kada kisika i glukoze gotovo nema, što može brže iscrpiti posljednje rezerve. Nakon povratka supstrata isto svojstvo postaje prednost jer pomaže oštećenim mitohondrijama da efikasno koriste ponovo dostupne kisik i glukozu. Zato i uz nalaze iz objašnjenja mitohondrijskog prijenosa elektrona treba navesti kontekst uskraćivanja.

Jedna napomena: ovo pravilo o vremenu primjene odnosi se na taj preparat astrocita. Povezana ćelijska studija s drugačijim tipom ćelija, blažim uskraćivanjem i nižom koncentracijom pokazala je zaštitu čak i pri izlaganju tokom uskraćivanja. Tip ćelija, preostali kisik, koncentracija i protokol određuju smjer učinka.

Hronično smanjen protok: pamćenje, citohrom-oksidaza i krvni sudovi tokom više sedmica

Hronični eksperimenti koristili su svakodnevni tretman malim dozama tokom više sedmica, a ne jedan hitni bolus. U prvoj studiji štakori s trajnom okluzijom karotidnih arterija primali su 4 mg/kg dnevno tokom jednog mjeseca, nakon svake dnevne sesije treninga, kako bi se djelovalo na konsolidaciju pamćenja, a ne na neposrednu izvedbu. Životinje s okluzijom sporije su učile zadatke vizuelnog razlikovanja i imale slabije rezultate na zahtjevnom testu pamćenja, dok sposobnost plivanja, motorička aktivnost i prepoznavanje mirisa nisu bili promijenjeni. Svakodnevni tretman ublažio je nedostatke u učenju i pamćenju bez promjene općeg motoričkog ponašanja.

U narednoj studiji mapirana je citohrom-oksidaza, odnosno mitohondrijski kompleks IV, u 44 moždane regije nakon istog jednomjesečnog režima. Okluzija je smanjila aktivnost enzima u vizuelnom, prefrontalnom i peririnalnom korteksu te hipokampusu i amigdali, a oslabila je i usklađenu aktivnost između vizuelnog korteksa i hipokampusa. Tretman je očuvao regionalnu aktivnost enzima i ojačao te međuregionalne metaboličke korelacije, a očuvana aktivnost korelirala je s boljim izvođenjem zadataka. Te korelacije opisuju usklađenu aktivnost metaboličkog enzima, a ne direktne mjere funkcionalne povezanosti kod ljudi, što pregledi energetskog metabolizma mozga pomažu jasno razgraničiti.

Odvojena jednos edmična studija koristila je 2 mg/kg dnevno i dodala inhibitor signalnog puta radi ispitivanja mehanizma. Cerebralni protok krvi uz tretman porastao je s oko 60 na oko 100 mL na 100 g u minuti, a gustoća krvnih sudova u hipokampusu porasla je s oko 15.1 na 23 posto. Oba povećanja djelimično su poništena kada je blokiran signalni put preživljavanja PI3K/Akt, a fosforilirani Akt povećao se uz tretman. Nalazi o protoku krvi, gustoći krvnih sudova, barijeri i neuronima upućuju na neurovaskularnu zaštitu povezanu sa signalizacijom PI3K/Akt, a ne na isključivo metabolički učinak.

Zašto ništa od ovoga nije isto što i hitno liječenje moždanog udara

Kontrolisani laboratorijski uslovi razlog su zbog kojeg se ovi rezultati ne mogu direktno prenijeti. Ćelije u kulturi nemaju tromb ni farmakokinetiku. Model 2VO predstavlja dugotrajan globalno smanjen protok, a ne iznenadnu žarišnu emboliju s penumbrom nastalom prije nekoliko minuta. Čak i MCAO kod štakora koristi mlade zdrave životinje, anesteziju, ujednačene okluzije i precizno tempiranu primjenu doza, za razliku od starijih pacijenata s različitim ugrušcima, aterosklerozom, hipertenzijom, dijabetesom i nepoznatim vremenom početka simptoma.

Nijedno objavljeno randomizirano ispitivanje na ljudima nije potvrdilo metilensko plavilo kao hitni tretman akutnog ishemijskog moždanog udara. Jedna povremeno citirana studija snimanja mozga kod ljudi uključila je 26 zdravih odraslih osoba, a ne pacijente s moždanim udarom, i jedna oralna doza promijenila je moždane signale povezane sa zadatkom, uz malo poboljšanje prisjećanja. To pokazuje djelovanje u centralnom nervnom sistemu, a ne djelotvornost kod moždanog udara. Aktuelne smjernice za hitno liječenje usmjerene su na brzu reperfuziju intravenoznom trombolizom kod pacijenata koji ispunjavaju kriterije i trombektomijom kod odgovarajućih okluzija velikih krvnih sudova, a standardni postupci hitnog zbrinjavanja moždanog udara ostaju jedini dokazani pristup. Zbrinjavanje sumnje na moždani udar nikada se ne smije odgađati radi primjene metilenskog plavila, a praktična ograničenja ekstrapolacije pretkliničkog doziranja objašnjavaju zašto se rasporedi primjene kod štakora ne mogu tumačiti kao klinički režimi.

Sigurnosni kontekst dodatno potvrđuje tu granicu. Intravenozno metilensko plavilo nosi upozorenje u crnom okviru o ozbiljnom ili smrtonosnom serotoninskom sindromu kada se kombinira sa serotonergičkim lijekovima, uključujući SSRI, SNRI i MAO inhibitore, koje uzimaju mnogi pacijenti u dobi u kojoj se javlja moždani udar. Kontraindicirano je kod nedostatka G6PD zbog rizika od hemolize. Također inhibira signalizaciju azotnog monoksida, što u nekim okolnostima povećava vaskularni otpor i pritisak, pa ga ne treba opisivati jednostavno kao lijek koji povećava protok krvi kroz mozak. Odobreni intravenozni režim od 1 mg/kg za stečenu methemoglobinemiju nije režim za moždani udar.

Pošten sažetak je ograničen, ali zasnovan na stvarnim nalazima. U periodu oko reperfuzije kod prolazne žarišne ishemije, male doze metilenskog plavila smanjile su napredovanje lezije kod štakora. Pri trajnoj okluziji odgodilo je infarkt, ali ga nije spriječilo. U astrocitima je štetilo tokom teškog uskraćivanja, a pomagalo pri ponovnoj oksigenaciji. Tokom hronične hipoperfuzije očuvalo je citohrom-oksidazu, krvne sudove i pamćenje tokom više sedmica. Jedan prenosilac, tri konteksta, tri odgovora.