Metilensko plavilo i hormeza: zašto krivulje odgovora na dozu mogu promijeniti smjer

Jedan štakor dobije 4 miligrama metilenskog plavila po kilogramu nakon što nauči prepoznavati predmet, a sljedećeg dana ga se sjeća. Drugi štakor dobije 50 i jedva okreće svoj točak za trčanje. Molekula je ista. Smjer učinka nije. Svako ko je pročitao više od nekoliko radova o metilenskom plavilu susreo se s ovim preokretom, koji ima ime: hormeza, dvofazni odgovor u kojem niska i visoka izloženost mijenjaju isti mjereni ishod u suprotnim smjerovima.

Taj naziv je koristan samo ako znate šta obećava, a šta ne. Ovaj članak razmatra četiri objavljena skupa podataka o metilenskom plavilu, svaki sa svojim mjerenim ishodom, rasponom koncentracija i eksperimentalnim uslovima, te pokazuje zašto hemija ove boje čini takve preokrete vjerovatnim. Završava upozorenjem koje podaci nalažu: krivulja koja dostiže vrhunac u jednom eksperimentu opisuje taj eksperiment i nije metoda za odabir lične doze.

Obrazac ima naziv, a njegovo značenje je uže nego što zvuči

Pojam hormeze uveli su Southam i Ehrlich 1943. godine, a Calabrese i Baldwin dali su mu savremeni kvantitativni oblik: adaptivni dvofazni odgovor, nastao neposredno ili kompenzacijom nakon poremećaja homeostaze. Obratite pažnju na ono što nedostaje u toj definiciji. Riječ koristan se ne pojavljuje. Hormeza govori da krivulja mijenja smjer, ništa više.

Oblik koji vidite zavisi od toga koji je mjereni ishod na vertikalnoj osi. Kada je taj ishod poželjna funkcija, poput aktivnosti enzima, potrošnje kisika ili rezultata testa pamćenja, stimulacija pri niskim dozama praćena inhibicijom pri visokim dozama daje oblik obrnutog U. Kada je ishod nešto nepovoljno, poput učestalosti bolesti, suzbijanje pri niskim dozama praćeno povećanjem pri visokim dozama daje oblik J ili U. Isti odnos, druga ordinata. Većina istraživanja metilenskog plavila mjeri poželjne funkcije, pa ovaj članak govori o krivuljama obrnutog U, uz razumijevanje da je slovo abecede izbor načina prikazivanja podataka.

Pregledni rad iz 2008. koji je objedinio hormetičke odgovore na metilensko plavilo daje konkretan uvid u veličinu učinka. U ponašanju, fiziologiji i biohemiji, odgovori unutar stimulacijske zone dostižu približno 130 do 160 posto kontrolne vrijednosti, uz prosjek blizu 140, prije nego što se, s daljnjim povećanjem doze, spuste do kontrolne vrijednosti, a zatim i ispod nje. Taj raspon sažima mnoge eksperimente i nije svojstvo molekule. Svaka krivulja u nastavku ima vlastiti vrhunac u vlastitim jedinicama.

Zašto bi upravo ova molekula trebala promijeniti smjer učinka

Metilensko plavilo nije jednostavan donor elektrona. Ono je reverzibilni prenosilac. Oksidirani plavi oblik prihvata elektrone i postaje bezbojni reducirani oblik, a reducirani oblik može te elektrone proslijediti dalje. Prijenos elektrona koji stoji iza ovih krivulja opisan je u prikazu načina na koji metilensko plavilo prenosi elektrone, a ovdje je upravo taj prijenos ključan.

Pri niskim koncentracijama, ovaj ciklus pruža alternativni put ćelijskom disanju. Reducirana boja može se oksidirati na citohrom-oksidazi, završnom enzimu lanca prijenosa elektrona, čime se povećava brzina njenog katalitičkog djelovanja, zajedno s potrošnjom kisika i respiratornim kapacitetom. Pri višim koncentracijama, ista hemijska sklonost prihvatanju elektrona počinje se nadmetati s normalnim lancem umjesto da mu pomaže: preusmjerava elektrone s njihovog uobičajenog puta, neposredno troši kisik i stvara reaktivne vrste kisika umjesto energije koja se može iskoristiti. Mala količina katalitičkog prenosioca povećava protok; prekomjerna količina koja konkurentno odvlači elektrone smanjuje ga. Hemija čini promjenu smjera vjerovatnom, ali ne garantira gdje će bilo koji pojedinačni mjereni ishod dostići vrhunac.

Nezavisni dokaz zavisnosti od koncentracije dolazi iz ćelija koje uopće nemaju mitohondrije. U eksperimentima s eritrocitima iz 1976., niska koncentracija od 1 mikromolara stimulirala je heksoza-monofosfatni put mehanizmom koji je snažno zavisio od oksihemoglobina, dok je stotinu puta viša koncentracija od 0.1 milimolara bila gotovo nezavisna od prisustva oksihemoglobina i stvarala vodikov peroksid, što su pokazale sve tri korištene metode ispitivanja. Ista boja, dva mehanizma, razdvojena koncentracijom. Eritrociti ne mogu obavljati ćelijsko disanje, pa ovo nije mitohondrijska krivulja, ali pokazuje da redoks-hemija boje mijenja karakter s porastom koncentracije, upravo kako to zahtijeva objašnjenje mitohondrijskog učinka.

Četiri krivulje, četiri eksperimentalne postavke

Slika u nastavku prikazuje četiri skupa podataka jedan pored drugog. Svaki panel zadržava vlastite ose i uslove, jer bi njihovo preklapanje na jednoj skali bila prva neistina koju bi ovaj članak mogao iznijeti. Prikaz je shematski; tačne vrijednosti i uslovi navedeni su u tekstu.

Panel A: citohrom-oksidaza u homogenatu mozga štakora. Najjasnija mitohondrijska krivulja prenesena je iz drugog izvora, prikazana u preglednom radu na osnovu podataka iz homogenata mozga štakora: oko 138 posto kontrolne aktivnosti pri 0.5 mikromolara, povratak na kontrolnu vrijednost oko 5 mikromolara, pad ispod početne vrijednosti oko 10 mikromolara, gdje autori pretpostavljaju da boja oduzima elektrone uobičajenim kompleksima lanca. Homogenat, mikromolari, spektrofotometrijsko ispitivanje. Ta rečenica obuhvata cijeli kontekst, a izvan njega krivulja ništa ne znači.

Panel B: pamćenje štakora i trčanje na točku. U istraživanju pamćenja štakora, učinci pojedinačnih injekcija nakon obuke ispitani su 24 sata kasnije. Pri dozama od 1 do 10 miligrama po kilogramu, lokomocija i hranjenje nisu se razlikovali od onih nakon fiziološke otopine, dok su doze od 50 do 100 miligrama po kilogramu znatno smanjile trčanje na točku (medijan 35 naspram 279 okretaja), a najviša doza izazvala je nakostriješenost dlake, nekoordinirano kretanje i jedan smrtni ishod. Doza od 4 miligrama po kilogramu poboljšala je habituaciju i prepoznavanje predmeta: tretirani štakori provodili su gotovo 10 sekundi više uz novi predmet. Potrošnja kisika u mozgu povećala se i u homogenatu izloženom niskim mikromolarnim koncentracijama reducirane boje i u mozgovima uzetim 24 sata nakon primjene 1 miligrama po kilogramu in vivo. Obratite pažnju na razliku: za ponašanje su korištene sistemske doze nakon obuke, a za potrošnju kisika koncentracije u homogenatu uz jednu dozu in vivo. To su dva eksperimenta, a ne jedna krivulja.

Panel C: T-labirint za zebrice. U istraživanju na zebricama, obučene ribe su nakon obuke uronjene na 12 sati u kupke s nominalnim koncentracijama od 0.1, 0.5, 5.0 ili 10.0 mikromolara, uz kontrolu s plavom prehrambenom bojom. Grupa izložena koncentraciji od 0.5 mikromolara postigla je najbolji rezultat, grupa od 5.0 imala je rezultat jednak kontroli, a grupa od 10.0 postigla je slabiji rezultat od grupa s nižim dozama. Uz ovaj panel dolaze dva upozorenja. Mikromolarna koncentracija u kupki nije mikromolarna koncentracija u krvi ili mozgu; raspodjela i nakupljanje posreduju između vode u akvariju i tkiva. Također, statistički dokazi slabiji su nego što oblik sugerira: grupa s visokom dozom razlikovala se od grupa s nižim dozama, a druge statistički značajne razlike među grupama nisu prijavljene. Krivulja je stvarna, ali grubo određena.

Panel D: heksoza-monofosfatni put u eritrocitima. Metz i kolege uporedili su 1 mikromolar s 0.1 milimolara u ljudskim eritrocitima u atmosferi zraka, ugljenmonoksida i mješavine koja je pri fiziološkom pritisku kisika dovodila do gotovo potpunog pretvaranja hemoglobina u karboksihemoglobin. Stimulacija pri niskoj dozi naglo je oslabila bez oksihemoglobina; stimulacija pri visokoj dozi gotovo se nije promijenila. Peroksid se pojavio samo pri visokoj dozi. Ovaj panel pripada uz ostale kao prikaz hemije, a ne kao četvrta tačka na nekoj univerzalnoj krivulji: nema mitohondrija, koncentracije se razlikuju stotinu puta, a sastav gasnih mješavina eksperimentalno je mijenjan.

Zašto se vrhunci ne podudaraju i zašto se ne trebaju podudarati

Četiri vrhunca nalaze se pri 0.5 mikromolara u homogenatu, 4 miligrama po kilogramu ubrizganih nakon obuke, 0.5 mikromolara u vodi akvarija i u paru niske i visoke koncentracije u eritrocitima koje se razlikuju stotinu puta. Smatrati bilo koja dva istim brojem znači poistovjetiti različite kategorije. Svaki mjereni ishod ima vlastitu krivulju: optimum za pamćenje ne mora se podudarati s optimumom za aktivnost oksidaze, potrošnju kisika, lokomociju ili stvaranje peroksida. Svaka jedinica koncentracije znači nešto drugo: mikromolarna koncentracija u homogenatu, nominalna mikromolarna koncentracija u kupki, sistemski miligrami po kilogramu te koncentracije u plazmi, mozgu i mitohondrijima različite su veličine, a sklonost metilenskog plavila da se nakuplja u mitohondrijima i mozgu održava te razlike. Svaki model dodaje vlastitu farmakokinetiku: vrsta, put primjene i vremenski raspored određuju koje je tkivo izloženo kojoj količini boje i koliko dugo.

Ovdje je važna i uloga doze i puta primjene u sigurnosti metilenskog plavila, jer su učinci visokih doza u ovim radovima, suzbijanje motoričke aktivnosti, nekoordinirano kretanje, jedan uginuli štakor i stvaranje peroksida, pokazatelji toksičnosti u njihovim eksperimentalnim uslovima, a ne granice sigurnosti za bilo koga drugog. Svako ko razmišlja o pretvaranju 4 miligrama po kilogramu kod štakora u režim primjene za ljude prvo treba pročitati kako se nalazi na životinjama odnose prema dokazima kod ljudi: jednostavno preračunavanje miligrama po kilogramu između vrsta nije primjereno.

Greška koju treba izbjeći

Obrnuto U djeluje primamljivo jer izgleda kao regulator doziranja s označenom optimalnom tačkom. To nije. Hormeza opisuje šta se dogodilo s jednim mjerenim ishodom u jednoj eksperimentalnoj postavci. Objedinite četiri takva opisa i dobit ćete četiri vrhunca u četiri sistema jedinica, što je suprotno od regulatora. Ove krivulje opravdano služe za poređenje i upozorenje: očekujte da se učinci preokrenu s promjenom koncentracije, očekujte da se svaki mjereni ishod preokrene na vlastitoj tački i ne vjerujte tvrdnjama koje koriste vrhunac iz jednog eksperimenta da opravdaju dozu za drugu vrstu, put primjene, tkivo ili svrhu. Razlika između eksperimentalnih obrazaca i odluka o ličnom doziranju suština je cijelog ovog članka, ponovljena kako ne bi bila propuštena.

Kako čitati sljedeći rad o odgovoru na dozu

Četiri pitanja primjenjiva su na gotovo svaku krivulju metilenskog plavila s kojom ćete se susresti. Koji je mjereni ishod na vertikalnoj osi i bi li njegov preokret dao oblik U ili J. Koju koncentraciju horizontalna osa zapravo prikazuje: nominalnu koncentraciju u kupki, koncentraciju u homogenatu ili plazmi, procijenjenu koncentraciju u mozgu ili primijenjenu sistemsku dozu. Koji model i vremenski raspored stoje iza nje: homogenat, ćelijska kultura sa svjetlom ili bez njega, obučene životinje koje su dobile dozu prije ili nakon obuke i vrijeme ispitivanja. I šta je bila kontrola: fiziološka otopina, plava prehrambena boja ili nosač te podržava li statistička analiza u radu svaku tvrdnju o poređenju parova ili samo ukupni oblik. Rad koji odgovara na sva četiri pitanja vrijedan je vašeg vremena. Rad koji navodi vrhunac bez tih podataka dao vam je broj bez konteksta.