Metilensko plavilo i Bartonella: laboratorijski nalazi i ograničenja kliničkih dokaza

Posuda za uzgoj kulture i pacijent dijele riječ infekcija, ali ne i isti pojam. U posudi se infekcija svodi na broj kolonija na agaru. Kod pacijenta ona obuhvata bakterije unutar ćelija i krvnih sudova, lijekove koji prolaze kroz krv i tkivo te imunološki sistem koji obavlja dio posla. Ako se to dvoje poistovjeti, upečatljiv laboratorijski broj počinje ličiti na postupak liječenja. Ako se jasno razdvoje, isti broj postaje ono što jeste: razlog za sljedeći eksperiment.

Upravo je to razdvajanje osnovni zadatak ovog pregleda metilenskog plavila i bakterija roda Bartonella. Dvije laboratorijske studije iste istraživačke grupe ispitale su metilensko plavilo protiv bakterije Bartonella henselae u stanjima bez rasta. Obje su zabilježile snažnu aktivnost u staklenim i plastičnim posudama. Nijedna nije uključivala ispitivanje na ljudima.

Zašto istraživači ispituju stacionarnu fazu

Većina ispitivanja antibiotika koristi ćelije koje rastu. Taj model izostavlja zahtjevniji slučaj: ćelije koje su se prestale dijeliti i podnose lijekove koji ubijaju njihove srodne ćelije u rastu.

Bartonella može opstati u tijelu, uključujući unutar eritrocita i endotelnih ćelija. Zato je grupa postavila pitanje koji odobreni lijekovi mogu ubiti B. henselae nakon što uđe u stacionarnu fazu. Niska MIC vrijednost za ćelije u rastu nije predviđala ubijanje ćelija u stacionarnoj fazi. Rifampin je imao vrlo nisku MIC vrijednost, ali je slabo ubijao stacionarne ćelije, dok su ih spojevi s višim MIC vrijednostima dobro ubijali. Čitaoci koji žele opću metodu za čitanje ovakvih radova pronaći će je u vodiču za čitanje istraživanja metilenskog plavila.

Prvo probirno ispitivanje: Li i saradnici, 2019

Probirno ispitivanje stacionarne faze iz 2019. u časopisu Antibiotics koristilo je jedan soj, B. henselae JK53, uzgojen u Schneiderovom mediju s 10 posto fetalnog goveđeg seruma na 37 C uz 5 posto CO2. Jednodnevne kulture uglavnom su sadržavale raspršene ćelije koje se dijele. Petodnevne kulture, s približno 10 na 8. potenciju jedinica koje formiraju kolonije po mL, smatrane su stacionarnom fazom i sadržavale su vidljive agregate.

Test je koristio SYBR Green I s propidij-jodidom, uz kalibraciju pomoću mješavina živih ćelija i ćelija ubijenih izopropanolom. Budući da je metilensko plavilo intenzivno obojeno, pozitivni rezultati potvrđeni su mikroskopijom, a zatim brojanjem kolonija na krvnom agaru, što je stroži krajnji kriterij.

Od 1,581 odobrenog lijeka ispitanog pri 50 mikromolara, nakon izlaganja metilenskom plavilu preostala je vijabilnost od 16 posto prema čitaču mikrotitarskih ploča i 25 posto prema mikroskopiji. Daptomicin je dao rezultat od 21 posto, nekoliko azola od 22 do 27 posto, gentamicin 32 posto, eritromicin 66 posto, a ciprofloksacin 74 posto. Pirvinij-pamoat pokazao je snažniji učinak na čitaču, ali ga nije bilo moguće ocijeniti mikroskopijom zbog njegove vlastite fluorescencije.

Za B. henselae u rastu MIC metilenskog plavila iznosio je 0.08 do 0.16 mikrograma po mL. Kod petodnevnih stacionarnih ćelija izloženih koncentraciji od 5 mikrograma po mL, nakon jednog dana izlaganja više nije bilo kolonija koje se mogu detektovati, kao ni kod daptomicina i pirvinij-pamoata pri njihovim ispitanim koncentracijama. U zasebnom ispitivanju ubijanja bakterija tokom vremena korišteno je 10 mikrograma po mL. To su laboratorijske koncentracije izlaganja, a ne doze, i rad ih tako navodi. Citirana vrijednost vršne koncentracije u plazmi kod ljudi od približno 3.9 mikrograma po mL pojavljuje se u radu samo kao kontekst. Pregled farmakokinetike metilenskog plavila objašnjava zašto se vrijednost u plazmi ne može tumačiti kao vrijednost u tkivu.

U radu su izričito navedena dva ograničenja. Nije korišten model biofilma niti su ispitivane kombinacije s metilenskim plavilom. Petodnevni agregati bili su nakupine u stacionarnoj tečnoj kulturi, a ne validiran eksperiment s biofilmom. Autori su pozvali na ispitivanja na životinjama, ispitivanja kombinacija i biofilma te ispitivanja drugih vrsta roda Bartonella.

Kombinacije i ćelije izdvojene iz biofilma: Zheng i saradnici, 2020

Nastavak istraživanja iz 2020. u časopisu BMC Microbiology zadržao je isti soj i medij, ali je prešao na šestodnevne stacionarne kulture i dodao dvije stvari koje su nedostajale u prvom radu: kombinacije dva lijeka i model ćelija izdvojenih iz biofilma.

Pri ispitivanju pojedinačnih lijekova, svi pri koncentraciji od 5 mikrograma po mL tokom 24 sata, nakon izlaganja metilenskom plavilu preostalo je 3.2 puta 10 na 4. potenciju jedinica koje formiraju kolonije po mL, u poređenju s kontrolom od približno 2.8 puta 10 na 10. potenciju. Nakon izlaganja ciprofloksacinu, gentamicinu i nitrofurantoinu u istoj vremenskoj tački preostalo je manje kolonija. To se razlikuje od rezultata iz 2019, kada pri istoj nominalnoj koncentraciji nakon jednog dana nije bilo kolonija koje se mogu detektovati. Starost kulture, gustoća i način rukovanja razlikovali su se, pa je učinak ubijanja ponovljen, ali ne u identičnom obimu. Ova razlika između ponovljenih ispitivanja jedan je od razloga zbog kojih se pri standardnim provjerama sigurnosti i interakcija laboratorijska potentnost razmatra odvojeno od kliničkog učinka.

Probirno ispitivanje kombinacija najčešće je citirani dio rada. Koncentracija svake komponente bila je fiksirana na 5 mikrograma po mL. I azitromicin s metilenskim plavilom i rifampin s metilenskim plavilom doveli su do toga da nakon 24 sata nije bilo kolonija stacionarne faze koje se mogu detektovati. Isto je važilo za obje kombinacije s ciprofloksacinom, a među 25 ispitanih parova samo su ta četiri dala takav rezultat. Nije provedena formalna analiza sinergije, pa je ispravan izraz aktivna kombinacija u ovim uslovima, a ne dokazana sinergija.

Eksperiment s biofilmom ispitivao je ćelije izdvojene iz mladog, razorenog biofilma, a ne prodiranje u netaknut, zreo biofilm. Kulture su uzgajane pet dana, razrijeđene i prenesene u ploče s jažicama na još pet dana, potvrđene bojenjem kristal-violetom, a zatim sastrugane prije izlaganja lijekovima. Pri 5 mikrograma po mL, broj kolonija nakon izlaganja samo metilenskom plavilu do 6. dana pao je na 2.3 puta 10 na 2. potenciju, što je bio jedan od najboljih rezultata pojedinačnih lijekova, ali nije dostigao nulu. Obje kombinacije s metilenskim plavilom dostigle su nulu do 6. dana, kao i obje kombinacije s ciprofloksacinom.

Autori su istakli ista ograničenja koja bi uočio pažljiv čitalac: mlad, sastrugan biofilm umjesto starog, netaknutog biofilma; jednu praktičnu koncentraciju za sve lijekove umjesto realistične vršne koncentracije svakog lijeka; samo odabrane parove s azitromicinom ili rifampinom; jedan soj; bez životinja i bez pacijenata. Kasnija ispitivanja s tri lijeka bila su predložena, ali rezultati nisu objavljeni.

Poređenje dizajna studija

Tabela sažeto prikazuje suštinu ovog članka. Sve lijevo od posljednje kolone odnosi se na rad s kulturama. Nijedan nalaz iz ova dva rada ne pripada posljednjoj koloni.

Bartonella nije Borrelia

Oba rada spominju Borrelia burgdorferi, spirohetu koja uzrokuje lajmsku bolest, jer je test s bojama potekao iz ranijih istraživanja stacionarne faze bakterija roda Borrelia u istoj laboratoriji, u kojima su metilensko plavilo i daptomicin također dali pozitivne rezultate probira. Ta historija pruža koristan kontekst i čest je izvor grešaka.

Nijedan eksperiment u ova dva rada o bakterijama roda Bartonella ne ispituje bakterije roda Borrelia uporedo s bakterijama roda Bartonella. Organizmi, mediji i koncentracije razlikuju se, a pretpostavljeni učinak metilenskog plavila na membranu bakterija roda Bartonella naveden je kao spekulacija koju treba dodatno istražiti. Rezultate ne treba prenositi s jedne vrste na drugu, a nijedan rad ne podržava opće tvrdnje o parazitima. Poređenje perzistentnih ćelija bakterija roda Borrelia i Bartonella upravo iz tog razloga razdvaja ove dvije oblasti literature.

Zašto rezultati kultura ne postaju protokol

Interes za pretraživanje protokola s metilenskim plavilom za bakterije roda Bartonella razumljiv je. Ovi radovi pokazuju zašto taj izraz treba smatrati znakom za oprez, a ne spiskom za kupovinu.

Prvo, 5 mikrograma po mL u jažici nije recept. Ta koncentracija ne uključuje apsorpciju, distribuciju, vezivanje za proteine, prodiranje u ćelije ni podnošljivost. Autori su je odabrali kao grubi prosjek vršnih koncentracija antibiotika i naveli da buduća ispitivanja trebaju koristiti realističnu koncentraciju svakog pojedinačnog lijeka.

Drugo, nula kolonija znači da nema kolonija u tim uslovima nasađivanja na agar, a ne da je tkivo sterilno. Perzistentne ćelije, unutarćelijske bakterije i ograničenja uzorkovanja ostaju izvan onoga što se može utvrditi na agarnoj ploči.

Treće, kombinacije koje sterilizuju jažicu mogu biti neuspješne ili štetne u tijelu. Azitromicin s metilenskim plavilom i rifampin s metilenskim plavilom laboratorijski su parovi pri laboratorijskim koncentracijama izlaganja. Bez farmakokinetičkih podataka iz ispitivanja na životinjama i kontrolisanih podataka iz ispitivanja na ljudima nisu utvrđeni ni doza, ni trajanje, ni omjer koristi i rizika. Svako ko razmatra mogućnosti treba o njima razgovarati s ljekarom i proučiti kada upotreba metilenskog plavila zahtijeva medicinski nadzor prije nego što izvede bilo kakav zaključak iz podataka dobijenih u posudi.

Ograničeni zaključak koji ovi radovi podržavaju glasi: metilensko plavilo pokazuje ponovljivu aktivnost protiv B. henselae JK53 koja ne raste in vitro, uključujući laboratorijske kombinacije dva lijeka, pri čemu najjači rezultati kombinacija i ispitivanja ćelija izdvojenih iz biofilma potiču iz studije iz 2020. Sve ostalo, uključujući pitanje ima li ta aktivnost značaja za bartonelozu kod ljudi, ostaje neispitano.