EMB agar naspram MacConkey agara: odabir i tumačenje podloga

Student zasijava isti uzorak vode na dvije podloge. Na jednoj se pojavljuju tamne kolonije sa zelenim metalnim sjajem. Na drugoj se pojavljuju jarko ružičaste kolonije sa zamućenim haloom. Obje podloge inokulirane su iz iste epruvete, inkubirane jedna pored druge i očitane u isto vrijeme. Student pita koja je podloga ispravna.

Obje podloge su ispravne. One odgovaraju na različita pitanja. Zabuna nastaje kada se dvije podloge tretiraju kao međusobno zamjenjivi testovi za crijevne bakterije. Imaju zajedničku svrhu, a to je selekcija Gram-negativnih enteričnih organizama i razlikovanje fermentatora laktoze od nefermentatora, ali tu svrhu ostvaruju različitom hemijom i različitom vizuelnom logikom. Kada shvatite dva osnovna koncepta, odabir podloge i očitavanje kolonija postaju rutinski.

Kratak odgovor

EMB agar koristi dvije boje, eozin Y i metilensko plavo, koje imaju dvostruku ulogu: potiskuju rast Gram-pozitivnih organizama i talože se oko snažnih proizvođača kiseline stvarajući tamne kolonije, klasično sa metalnim zelenim sjajem kod Escherichia coli. MacConkey agar razdvaja te funkcije: žučne soli i kristal violet potiskuju Gram-pozitivne organizme, laktoza omogućava fermentaciju, a neutralno crveno pokazuje stvaranje kiseline kroz ružičaste ili crvene kolonije. Ako je zadatak upečatljiva presumptivna demonstracija E. coli, EMB ima svoje mjesto. Ako je zadatak jasno razlikovanje ružičastih fermentatora laktoze od bezbojnih nefermentatora, naročito u postupcima s uzorcima stolice ili urina, MacConkey je obično jednostavniji za očitavanje. Nijedna podloga ne identificira organizam samo na osnovu boje.

EMB: boje koje istovremeno selektiraju i pokazuju reakciju

Koncept EMB-a objedinjuje selekciju i indikaciju u istim molekulama. ASM protokol za eosin methylene blue agar opisuje EMB kao selektivnu i diferencijalnu podlogu, pri čemu par boja inhibira mnoge Gram-pozitivne organizme, dok fermentacija laktoze dovodi do vezivanja i taloženja boje. Standardna Levine formulacija sadrži pepton, laktozu, fosfat, eozin Y, metilensko plavo i agar, kako je navedeno u FDA BAM metodi za Levine EMB agar. Imajte na umu da su starije EMB recepture ponekad sadržavale saharozu uz laktozu, dok Levine EMB sadrži laktozu bez saharoze, pa zabilježite koju formulaciju koristi vaša laboratorija.

Očitavanje EMB-a znači praćenje ponašanja boja. Intenzivna fermentacija laktoze proizvodi dovoljno kiseline da izazove snažno taloženje boje, dajući E. coli tamne plavo-crne centre i, u klasičnom slučaju, zeleni metalni sjaj u reflektiranom svjetlu. Slabiji fermentatori kao što su Enterobacter i Klebsiella obično rastu kao ružičaste do ljubičaste mukoidne kolonije bez tog sjaja. Nefermentatori kao što su Salmonella, Shigella i Proteus uglavnom rastu kao bezbojne ili prozirne kolonije jer ne proizvode nagli porast kiseline koji dovodi do taloženja boja. Gram-pozitivni organizmi obično su potisnuti, iako je stepen potiskivanja promjenjiv i zavisi od soja i proizvoda. Potpuna hemija pripreme boja, uključujući razlog zbog kojeg se metilensko plavo uopće ponaša kao kationska boja, pripada zasebnoj raspravi o formulacijama boja, dok se opći mikroskopski kontekst nalazi u atlasu metoda bojenja. Ovaj članak ostaje usmjeren na odabir podloge i očitavanje.

Gornja slika je ilustrativna. Prikazuje očekivanu vizuelnu logiku: tamne kolonije sa sjajem, ružičaste mukoidne tipove i blijede tipove na EMB-u, nasuprot ružičastim i blijedim tipovima na MacConkey podlozi. Koristite je za učenje obrasca, a zatim svako očitavanje potvrdite pomoću fotografiranih kontrola i uputstva proizvođača za tačnu podlogu koju koristite.

MacConkey: odvojene funkcije, jednostavnije vizuelno pravilo

Koncept MacConkey podloge svakoj funkciji dodjeljuje poseban sastojak. ASM protokol za MacConkey agar predstavlja isti selektivni i diferencijalni princip, a FDA BAM metoda za MacConkey agar navodi funkcionalne sastojke: peptone, laktozu, žučne soli, sol, neutralno crveno, kristal violet i agar. Žučne soli i kristal violet selektiraju protiv Gram-pozitivnih organizama. Laktoza služi kao supstrat za fermentaciju. Neutralno crveno djeluje kao indikator pH, prelazeći u ružičastu do crvenu boju tamo gdje nastaje kiselina, ponekad uz taloženje žuči oko snažnih fermentatora.

Pravilo očitavanja namjerno je jednostavno: ružičasto znači fermentator laktoze, a bezbojno ili blijedo znači nefermentator. E. coli se pojavljuje ružičasto do crveno, često sa haloom taloga žuči. Klebsiella i Enterobacter pojavljuju se ružičasto i često mukoidno zbog svojih kapsula. Salmonella, Shigella, Proteus i mnogi drugi Gram-negativni štapići pojavljuju se bezbojno. Jedna dodatna prednost važna je u nastavnim laboratorijama: žučne soli uglavnom smanjuju rojenje Proteus vrsta, pa je na MacConkey podlozi lakše dobiti izolirane kolonije nego na neselektivnim podlogama, iako potiskivanje nije potpuno i postoje alternative bez soli kada je kontrola rojenja prioritet.

Molekularni razlog zbog kojeg se boje ponašaju na ovaj način proizlazi iz naboja i strukture. Metilensko plavo je kationska fenotiazinska boja čija struktura i svojstva objašnjavaju njen afinitet prema kiselim bakterijskim površinama, isti onaj afinitet koji djeluje kada se taloži u kiselim zonama na EMB-u.

Poređenje na prvi pogled

Tabelu čitajte kao postupak odlučivanja. Kada vježba zahtijeva da studenti vide gradijent jačine fermentacije sa jednim upečatljivim krajnjim rezultatom, EMB to prikazuje. Kada vježba zahtijeva brzo binarno razvrstavanje prije biohemijske potvrde, MacConkey to prikazuje.

Koja podloga za koji uzorak

Za vježbe s vodom usmjerene na presumptivno prepoznavanje fekalnih koliforma ili E. coli, EMB je privlačan jer je sjaj vizuelno prepoznatljiv. MacConkey također podržava rast enteričnih Gram-negativnih organizama i historijski se koristio u analizi vode, ali nijedna podloga nije zamjena za regulatorno propisanu metodu analize vode, koja može zahtijevati podloge kao što su modificirani mTEC ili MI, zavisno od testa. Provjerite metodu koju je vaša laboratorija obavezna slijediti.

Za razdvajanje fermentatora od nefermentatora u postupcima sličnim analizi stolice, MacConkey je općenito korisniji od ove dvije podloge. Praktični rad s uzorcima stolice radi izolacije Salmonella ili Shigella obično uključuje dodatne, selektivnije enterične podloge kao što su XLD ili Hektoen enteric, umjesto oslanjanja samo na MacConkey.

Za nastavne vježbe s urinom koje oponašaju klinički radni tok, kombinirajte MacConkey s krvnim agarom. MacConkey omogućava rano razvrstavanje Gram-negativnih organizama, dok krvni agar omogućava rast organizama koje MacConkey potiskuje. Ova kombinacija standardna je u kliničkim opisima postavljanja urinokulture.

Za čisto konceptualnu nastavu koristite obje podloge. EMB pokazuje da je jačina fermentacije važna i da jedna molekula može imati dvije uloge. MacConkey pokazuje modularni dizajn: selektor, supstrat i indikator ostaju odvojeni. Studenti koji zasiju poznatu E. coli, poznatu Klebsiella aerogenes i poznatu Salmonella jednu pored druge na obje podloge rijetko ponovo pomiješaju ove dvije logike.

Zamke pri očitavanju koje se ponavljaju svakog semestra

Najčešća greška je identifikacija samo na osnovu boje. Ružičasta kolonija na MacConkey podlozi može biti E. coli, Klebsiella, Enterobacter ili neki drugi fermentator. Bezbojna kolonija može biti Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas ili neki drugi nefermentator. Boja je probirni fenotip koji usmjerava daljnju potvrdu, kao što su bojenje po Gramu, oksidaza, biohemijski paneli ili instrumentalna identifikacija, a ne naziv vrste.

Druga greška je pridavanje prevelikog značaja odsustvu sjaja. Neke stvarne kolonije E. coli, naročito izolirane, stvaraju malo ili nimalo metalnog sjaja na EMB-u. Odsustvo sjaja ne isključuje E. coli, a njegovo prisustvo je ne potvrđuje. Sjaj tretirajte kao presumptivni pokazatelj.

Treća greška je poređenje podloga različite starosti. Odgođeni fermentatori laktoze mogu postati ružičasti na MacConkey podlozi nakon produžene inkubacije, što zamagljuje jasno razdvajanje fermentatora od nefermentatora. Očitajte podlogu u vrijeme koje je propisala laboratorija i zabilježite trajanje inkubacije uz rezultat.

Četvrta greška je tumačenje miješanog rasta kao jednog organizma. Ružičasta kolonija pored bezbojne kolonije predstavlja dva fenotipa, a ne prijelazni oblik. Odaberite dobro izolirane kolonije i svaki morfotip obrađujte zasebno. Mukoidna tekstura predstavlja sličnu zamku: i Klebsiella i Enterobacter mogu izgledati mukoidno, pa sama kapsula nikada nije dovoljna za određivanje naziva. Organizam koji se ranije podučavao kao Enterobacter aerogenes sada je klasificiran kao Klebsiella aerogenes, što objašnjava zašto se starije tabele i novije oznake naizgled ne slažu.

Kontrole i završno pravilo

U svakoj sesiji koristite fotografirane ili svježe kontrole: E. coli za reakciju snažnog fermentatora, Klebsiella aerogenes za mukoidnu fermentaciju bez klasičnog sjaja, soj Salmonella za bezbojnu reakciju nefermentatora i Staphylococcus aureus za potvrdu potiskivanja Gram-pozitivnih organizama na tačno određenom proizvodu koji koristite. Brojeve sojeva i kriterije prihvatljivosti uskladite s uputstvom proizvođača, jer se selektivnost mijenja s udjelom žuči, kristal violeta i boja.

Zapamtite jednu rečenicu za rad za laboratorijskim stolom. EMB koristi boje koje istovremeno selektiraju i pokazuju reakciju, čime daje upečatljiv signal E. coli uz cijenu suptilnijeg očitavanja. MacConkey odvaja selekciju od indikacije, čime omogućava jednostavno razlikovanje ružičastog od blijedog uz cijenu manjeg broja detalja o fermentaciji. Odaberite podlogu čiji koncept odgovara pitanju, potvrdite boju odgovarajućim testovima i dvije podloge prestaju konkurirati jedna drugoj i počinju se dopunjavati.