Метиленово синьо и ATP: означава ли повече кислород повече енергия?

Изолирана митохондрия се намира в камера с гориво, но без ADP. Тя консумира кислород бавно. При добавяне на ADP консумацията на кислород нараства няколко пъти. След изчерпване на ADP консумацията на кислород отново спада. Горивото не се е променило. Променила се е само потребността от ATP.

Тази кратка последователност съдържа цялото разграничение, за което става дума в тази статия. Консумацията на кислород измерва колко бързо електроните преминават през дихателната верига към кислорода. Производството на ATP измерва каква част от този поток се улавя като използваема енергия. Двете имат общ междинен етап — протонния градиент през вътрешната митохондриална мембрана. Всичко, което променя колко тясно градиентът е спрегнат със синтеза на ATP, може да промени двата крайни показателя в различни посоки. Метиленовото синьо е полезен пример тук, защото при него са наблюдавани и двата случая: в някои препарати то увеличава използването на кислород заедно с ATP, а в други увеличава използването на кислород, докато ATP остава непроменен или спада.

Читателите, които първо искат по-обща представа за преноса, могат да започнат с това как метиленовото синьо пренася електрони през дихателната верига. А тези, които искат да се запознаят с терминологията на ранните експерименти с кислород, могат да прочетат какво всъщност са показали първите измервания на дишането.

Дишането, ATP и градиентът между тях

Електроните от NADH и FADH2 навлизат във веригата при комплекси I и II, преминават през комплекс III към цитохром c, а след това през комплекс IV към кислорода. Енергията, освободена при комплекси I, III и IV, изпомпва протони от матрикса в междумембранното пространство. Това разделяне на заряда и киселинността създава протон-движещата сила, а електрическата ѝ съставка — мембранният потенциал — обикновено е преобладаващата част.

ATP синтазата позволява на протоните да се върнат в матрикса и използва освободената енергия, за да свърже ADP и фосфат в ATP. Така последователността е:

консумация на кислород, след това изпомпване на протони, след това градиент, след това синтез на ATP.

Уловката е, че протоните могат да се връщат и по други пътища. Всяко връщане, което заобикаля ATP синтазата, е протонно изтичане. Изтичането принуждава веригата отново да изпомпва същите протони, за да поддържа мембранния потенциал стабилен. Това изразходва повече кислород, без да произвежда повече ATP. Достатъчно силното изтичане води до разпрягане: използването на кислород нараства, докато ATP остава непроменен или спада, а неоползотворената енергия се отделя като топлина.

Състояние 3, състояние 4 и коефициентът на дихателен контрол

Класическата терминология за това произхожда от изследванията на изолирани митохондрии. Състояние 3 е дишане в присъствието на субстрат и ADP: ATP синтазата намалява градиента, мембранният потенциал спада, веригата се ускорява, за да го възстанови, и използването на кислород е високо, защото се произвежда ATP. Състояние 4 е дишане след изчерпване на ADP: ATP синтазата бездейства, градиентът се увеличава, високият мембранен потенциал затруднява по-нататъшното изпомпване, а използването на кислород спада до нивото, необходимо за компенсиране на изтичането.

Следователно коефициентът на дихателен контрол — дишането в състояние 3, разделено на дишането в състояние 4 — показва колко тясно е спрегнат препаратът. Високият коефициент означава, че ADP силно контролира дишането. Спадащ коефициент при нарастващо дишане в състояние 4 означава, че изтичането започва да преобладава. Именно през тази призма стават разбираеми представените по-долу резултати за метиленовото синьо.

Струва си да запомните един мисловен модел. Високият мембранен потенциал забавя веригата. Разсейването на потенциала я ускорява. Веригата реагира на това колко трудно е станало изпомпването, а не пряко на това дали се произвежда ATP.

Когато крайните показатели се променят заедно

Най-ясният пример за спрягане идва от изолирани митохондрии от мозък на морско свинче с блокирани дихателни комплекси. При концентрации на метиленово синьо от 100 наномолара до 1 микромолар консумацията на кислород в покой нараства с глутамат плюс малат, сукцинат или глицерофосфат като гориво, докато стимулираното от ADP дишане остава непроменено. В митохондрии с токсично блокиран комплекс I или комплекс III багрилото умерено увеличава производството на ATP, възстановява мембранния потенциал и подобрява поемането на калций. Предложеният път е обходен: багрилото приема електрони преди блокирания участък и ги предава на цитохром c, заобикаляйки увредения комплекс.

Втори случай, при който показателите се променят заедно, използва съвсем различен източник на ATP. В изолирани мозъчни митохондрии с инхибирана ATP синтаза метиленовото синьо продължава да стимулира дишането с всеки изследван субстрат. Но синтезът на ATP нараства само при алфа-кетоглутарат и глутамат — двата субстрата, от които се образува сукцинил-CoA. При блокирана от олигомицин ATP синтаза допълнителният ATP идва от субстратно фосфорилиране чрез сукцинил-CoA лигазата в цикъла на лимонената киселина, а не от окислително фосфорилиране. Багрилото също така възстановява мембранния потенциал, когато комплекс I и ATP синтазата са инхибирани едновременно. Тук използването на кислород и ATP се променят заедно, но само когато субстратът позволява втория път за образуване на ATP. При сукцинат или малат дишането нараства без допълнителен ATP. Същото багрило, същата камера, различно гориво, различен отговор.

Когато крайните показатели се разминават

Случаите на разминаване също са публикувани и са също толкова показателни. В изследване от 1997 г. върху изолирани митохондрии от черен дроб на плъх метиленовото синьо ускорява дишането в състояние 4 в тясно спрегнати митохондрии, използващи сукцинат, което понижава коефициента на дихателен контрол. Ефектът е видим от 0.5 микромолара и е силен при 5 микромолара — концентрация, близка до плазмените нива след интравенозен болус от 100 милиграма. При 5 микромолара митохондриите също набъбват, въпреки че нарушението на спрягането се появява първо при по-ниски концентрации. Това подкрепя извода, че изтичането предхожда структурното увреждане, а не произтича от него. В разпрегнати митохондрии багрилото стимулира дишането по зависим от концентрацията начин, който достига насищане. Използването на кислород нараства и в двата препарата. Синтезът на ATP на единица консумиран кислород не нараства. Това е класическо разпрягане плюс пренос на електрони, извършвани от една и съща молекула.

Най-яркото разминаване идва от ретината. При мишки с дефицит на AIF и фоторецепторни клетки, третирани с ротенон метиленовото синьо запазва дебелината на ретината, фоторецепторните маркери и митохондриалната структура, понижава съотношението NADH към NAD и потиска пътищата на стресов отговор, включително отговора към неправилно нагънати белтъци и митофагията. То прави това, без да коригира недостига на ATP. Защитата без възстановяване на енергията означава, че ползата преминава през редокс баланса и митохондриалната цялост, а не през допълнителен ATP. Всеки, който приравнява оцеляването на тъканта с възстановен енергиен добив, би разчел този експеримент напълно погрешно.

Изследването върху мозъчни митохондрии добавя и цена към същата равносметка. Същите ниски концентрации, които подобряват биоенергетиката, увеличават и образуването на водороден пероксид при всички изследвани условия и забавят отстраняването му. Това е измерено с калибриран анализ Amplex, а не с неспецифично багрило. Повече ATP и повече оксидант вървят заедно.

Практичен списък за проверка при четене

Четири въпроса разграничават резултат със спрягане от резултат с разпрягане.

Първо, кой краен показател всъщност е измерен. Само консумацията на кислород не може да даде информация за ATP. Синтезът на ATP, мембранният потенциал и коефициентът на дихателен контрол добавят по един елемент, който кислородният електрод не може да отчете. Ръководството за разчитане на твърденията в изследванията на метиленовото синьо разглежда подробно този подход към крайните показатели.

Второ, кой субстрат е захранвал митохондриите. Резултатът със сукцинил-CoA показва, че изборът на гориво може да определи дали допълнителното дишане изобщо може да се превърне в допълнителен ATP.

Трето, каква концентрация е използвана. Метиленовото синьо в наномоларни до ниски микромоларни концентрации в мозъчни митохондрии води до умерени биоенергетични подобрения, но с оксидантна цена; половин микромолар и повече в чернодробни митохондрии нарушава спрягането; при 5 микромолара се добавя и набъбване. Концентрацията е част от механизма, а не второстепенна подробност.

Четвърто, в какъв модел е получен резултатът. Изолираните митохондрии разкриват схемата на процесите, но интактните клетки и тъкани добавят транспорт, редукция до безцветната форма и конкуриращи се приемници на електрони. Лабораторните изследвания на дозирането, включително как концентрацията и протоколът определят ефектите на метиленовото синьо, са мостът между стойностите в камерата и всяко твърдение за човек.

Консумацията на кислород показва потока от електрони. ATP показва каква част от този поток е уловена. Метиленовото синьо може да промени всеки от двата показателя, а експериментите по-горе показват и четирите произтичащи комбинации: и двата нарастват; дишането нараства, но ATP се увеличава само когато субстратът го позволява; дишането нараства, докато спрягането намалява; и тъканта е запазена, докато ATP остава непроменен. Стойността, отчетена от кислородния електрод, е началото на интерпретацията, а не нейният край.