Метиленово синьо в изследванията на инсулта и церебралната хипоперфузия: какво всъщност показват три модела

Запушена артерия, клетъчна култура без хранителни субстрати и плъх със стеснени шийни артерии звучат като три варианта на един експеримент. Но не са. Всеки поставя различен въпрос и метиленовото синьо дава различен отговор във всеки от тях. Ако ги смесим, научната литература изглежда противоречива. Ако ги разграничим, се очертава ясна закономерност, определяна най-вече от момента на приложение.

Именно това разграничение е основната цел на този преглед. Трите модела са остър фокален инсулт, кислородно-глюкозна депривация с реоксигенация в култивирани клетки и хронична церебрална хипоперфузия в продължение на седмици. Предложеният механизъм, който ги свързва, е митохондриален, но резултатите се различават, защото метаболитният контекст е различен.

Трите модела отговарят на различни въпроси

Острият фокален инсулт при плъхове обикновено се предизвиква чрез оклузия на средната мозъчна артерия, съкратено MCAO. Запушване, подобно на причиненото от тромб, създава исхемично ядро, заобиколено от пенумбра — застрашена тъкан, която потенциално може да бъде спасена, ако кръвотокът се възстанови. Въпросът тук е дали дадена интервенция забавя разрастването на инфаркта или запазва функцията около момента на реперфузията.

Кислородно-глюкозната депривация, съкратено OGD, работи на противоположния мащаб. Култивирани мозъчни клетки се поставят при почти нулево съдържание на кислород и без глюкоза, след което се връщат в нормална среда. Няма тромб, колатерално кръвообращение, кръвно налягане или имунна система. Въпросът е изцяло клетъчен: какво се случва с дишането, ATP и преживяемостта, когато субстратите изчезнат и след това се възстановят.

При хроничната церебрална хипоперфузия се използва постоянна двустранна оклузия на каротидните артерии при плъхове, наречена модел 2VO. Кръвотокът към предния мозък намалява и остава нисък в продължение на седмици. Няма внезапен фокален инфаркт и спешна реперфузия. Въпросът е дали метаболитната подкрепа в продължение на седмици запазва съдовете, митохондриите и паметта при продължително намален кръвоток.

Следователно подобрение на паметта след един месец лечение в модела 2VO не казва нищо пряко за спасяването на човешка мозъчна тъкан по време на спешна тромбектомия. Това разграничение е важно, защото повечето оптимистични обобщения го пропускат.

Остър инсулт: защита при реперфузия, забавяне без нея

Най-ясният резултат при острия модел идва от временна MCAO с реперфузия. Плъховете са подложени на 60 минути оклузия, след което получават ниска доза метиленово синьо интравенозно, започвайки при реперфузията, с допълнителни дози на 3 часа и на ден 2. ЯМР показва, че до ден 2 лезията в групата, получила само носителя, нараства с около 19 процента, докато в третираната група намалява с около 17 процента, с приблизително 30 процента по-малки крайни инфаркти и по-добри неврологични показатели на дни 2 и 7. Образните изследвания показват подобрено запазване на тъканта както в ядрото, така и в пенумбрата. По-широката литература за неврозащитата разглежда тази защита, свързана с момента на реперфузията, наред с резултатите при глобална исхемия и травма.

Картината се променя, когато артерията остава запушена. В експеримент с постоянна MCAO метиленовото синьо, приложено по време на продължаващата исхемия, забавя разширяването на лезията на дифузионните изображения и за кратко удължава перфузионно-дифузионното несъответствие, с леко подобрение на локалния кръвоток, но крайният обем на инфаркта на 24 часа не се различава значимо. То забавя преминаването на застрашената тъкан в инфаркт, без да замества повторното отваряне на съда.

Трето изследване при остър модел добавя подробности за механизма и дозата. Единична интраперитонеална доза непосредствено след оклузията показва най-голямо намаление на инфаркта, около 50 процента, при междинна доза от 5 mg/kg, а не при 1 или 10 mg/kg, наред с по-добри сензомоторни показатели. Авторите свързват това със запазена митохондриална структура и засилена митофагия — селективното отстраняване на увредени митохондрии. Следователно дозата, пътят и схемата на приложение имат значение, а стойностите в mg/kg при плъхове не са дози за лечение на инсулт при хора.

Клетъчна култура: едно и също вещество помага или вреди според момента на приложение

Експериментът с астроцити е най-показателният и най-често цитираният неточно. Първични кортикални астроцити от мишки са подложени на 6 часа тежка депривация при 0.1 процента кислород в среда без глюкоза, пируват или серум, последвана от 24 часа реоксигенация с възстановени субстрати. Около половината клетки загиват, което позволява на теста да отчете ефект и в двете посоки.

Когато метиленовото синьо присъства по време на фазата на депривация, преживяемостта се влошава, а не се подобрява. Когато вместо това се добавя при реоксигенацията, ниските микромоларни концентрации подобряват жизнеспособността и увеличават консумацията на кислород, усвояването на глюкоза и производството на ATP. При нормални условия същите концентрации увеличават усвояването на глюкоза с приблизително 89 процента при 0.1 микромоларна концентрация и с около 200 процента при 1 микромоларна концентрация, със запазени гликоген и хексокиназна активност след увреждането и без измерено увеличение на супероксида.

Механизмът е по-лесен за разбиране чрез аналогия с резервен генератор. Метиленовото синьо действа като алтернативен преносител на електрони, който приема редуциращи еквиваленти и ги предава към цитохром c и комплекс IV, като подпомага електронния поток и синтеза на ATP и същевременно намалява изтичането на електрони от предходните звена на веригата. При тежка депривация тази стимулация е неблагоприятна, защото повишава метаболитните нужди, когато кислородът и глюкозата почти липсват, което може да изчерпи по-бързо последните резерви. След възстановяването на субстратите същото свойство става предимство, защото помага на увредените митохондрии да използват ефективно възстановените кислород и глюкоза. Ето защо резултатите от обясненията за митохондриалния пренос на електрони трябва да се разглеждат с уточнение за условията на депривация.

Една уговорка: това правило за момента на приложение се отнася до конкретния астроцитен препарат. Съпътстващо клетъчно изследване с различен клетъчен тип, по-лека депривация и по-ниска концентрация установява защита дори при експозиция по време на депривацията. Клетъчният тип, остатъчният кислород, концентрацията и протоколът определят посоката на ефекта.

Хронично намален кръвоток: памет, цитохромоксидаза и съдове в продължение на седмици

Хроничните експерименти използват ежедневно лечение с ниски дози в продължение на седмици, а не единичен спешен болус. В първото изследване плъхове с постоянна каротидна оклузия получават 4 mg/kg ежедневно в продължение на един месец, след всяка ежедневна тренировъчна сесия, с цел повлияване на консолидацията на паметта, а не на непосредственото изпълнение. Животните с оклузия усвояват по-бавно задачите за зрително разграничаване и се представят по-зле при труден тест на паметта, докато способността за плуване, двигателната активност и разпознаването на миризми остават незасегнати. Ежедневното лечение намалява нарушенията в ученето и паметта, без да променя общото двигателно поведение.

Последващо изследване картографира цитохромоксидазата, която представлява митохондриален комплекс IV, в 44 мозъчни области след същата едномесечна схема. Оклузията понижава ензимната активност в зрителната, префронталната и перириналната кора, както и в хипокампа и амигдалата, и отслабва координираната активност между зрителната кора и хипокампа. Лечението запазва регионалната ензимна активност и засилва тези междурегионални метаболитни корелации, а запазената активност корелира с по-добро изпълнение на задачите. Тези корелации описват координирана активност на метаболитни ензими, а не преки измервания на функционалната свързаност при хора — разграничение, което прегледите на мозъчния енергиен метаболизъм помагат да се запази.

Отделно едноседмично изследване използва 2 mg/kg ежедневно и добавя инхибитор на сигнален път, за да провери механизма. При лечението мозъчният кръвоток нараства от около 60 до около 100 mL на 100 g за минута, а съдовата плътност в хипокампа се увеличава от около 15.1 до 23 процента. И двете подобрения са частично отменени при блокиране на сигналния път PI3K/Akt, свързан с клетъчната преживяемост, а фосфорилираният Akt се повишава при лечението. Резултатите за кръвотока, съдовата плътност, бариерата и невроните сочат невроваскуларна защита, свързана със сигнализацията PI3K/Akt, а не чисто метаболитен ефект.

Защо нищо от това не е равнозначно на спешно лечение на инсулт

Контролираните лабораторни условия са причината тези резултати да не могат да се пренасят пряко. При култивираните клетки няма тромб или фармакокинетика. Моделът 2VO представлява продължително глобално намаляване на кръвотока, а не внезапен фокален ембол с пенумбра, възникнала преди минути. Дори MCAO при плъхове използва млади здрави животни, анестезия, еднотипни оклузии и точно определени моменти на дозиране, за разлика от по-възрастните пациенти с различни тромби, атеросклероза, хипертония, диабет и неизвестен момент на начало.

Нито едно публикувано рандомизирано изпитване при хора не е установило метиленовото синьо като спешно лечение за остър исхемичен инсулт. Понякога цитирано образно изследване при хора включва 26 здрави възрастни, а не пациенти с инсулт, и единична перорална доза променя мозъчните сигнали, свързани с изпълнението на задачи, с малко подобрение при извличането на информация от паметта. Това показва активност в централната нервна система, а не ефикасност при инсулт. Вместо това настоящите препоръки за спешна помощ са съсредоточени върху бързата реперфузия с интравенозна тромболиза при подходящи пациенти и тромбектомия при подходящи оклузии на големи съдове, а стандартните алгоритми за спешно лечение на инсулт остават единственият доказан подход. При съмнение за инсулт спешната помощ никога не бива да се отлага заради приложение на метиленово синьо, а практическите ограничения при екстраполирането на предклинични дози обясняват защо схемите при плъхове не могат да се тълкуват като клинични режими.

Съображенията за безопасност допълнително подчертават тази граница. Интравенозното метиленово синьо има предупреждение в рамка за сериозен или фатален серотонинов синдром при комбиниране със серотонинергични лекарства, включително SSRIs, SNRIs и МАО инхибитори, които много пациенти във възрастта, характерна за инсулт, приемат. То е противопоказано при дефицит на G6PD поради риск от хемолиза. Освен това потиска сигнализацията на азотния оксид, което в някои условия повишава съдовото съпротивление и налягането, така че не бива да се описва просто като лекарство, което увеличава мозъчния кръвоток. Одобреният интравенозен режим от 1 mg/kg за придобита метхемоглобинемия не е режим за лечение на инсулт.

Коректното обобщение е ограничено, но се опира на реални резултати. Около момента на реперфузията при временна фокална исхемия ниските дози метиленово синьо ограничават развитието на лезията при плъхове. При постоянна оклузия то забавя, но не предотвратява инфаркта. При астроцити вреди по време на тежка депривация и помага при реоксигенация. При хронична хипоперфузия запазва цитохромоксидазата, съдовете и паметта в продължение на седмици. Един преносител, три контекста, три отговора.