Метиленово синьо и Bartonella: лабораторни резултати и ограничения на клиничните доказателства

Съдът за култивиране и пациентът споделят една дума — инфекция — но не и едно понятие. В съда инфекцията е брой колонии върху агар. При пациента тя означава бактерии вътре в клетките и съдовете, лекарства, които се придвижват през кръвта и тъканите, и имунна система, която върши част от работата. Ако объркате двете, впечатляващият лабораторен резултат започва да изглежда като лечение. Ако ги разграничите, същият резултат се превръща в това, което всъщност е: основание за следващия експеримент.

Именно това разграничение е основната задача на настоящия преглед за метиленовото синьо и Bartonella. Две лабораторни изследвания от една изследователска група изпитват метиленово синьо срещу Bartonella henselae в състояния без растеж. И двете съобщават за силна активност в стъклени и пластмасови съдове. Нито едно не го изпитва при човек.

Защо изследователите изпитват стационарната фаза

Повечето изпитвания на антибиотици използват растящи клетки. Този модел пропуска по-трудния случай: клетки, които са спрели да се делят и понасят лекарства, убиващи техните растящи събратя.

Bartonella може да персистира в организма, включително вътре в еритроцити и ендотелни клетки. Затова групата проучва кои одобрени лекарства могат да убият B. henselae, след като тя е навлязла в стационарна фаза. Ниската минимална инхибираща концентрация (MIC) срещу растящи клетки не предсказва унищожаването на клетки в стационарна фаза. Рифампицинът има много ниска MIC, но убива слабо стационарните клетки, докато съединения с по-високи стойности на MIC ги убиват добре. Читателите, които търсят общ подход към подобни публикации, ще го намерят в ръководството за четене на изследвания за метиленовото синьо.

Първи скрининг: Li и съавтори, 2019

Скринингът на стационарната фаза от 2019 г. в Antibiotics използва един щам, B. henselae JK53, култивиран в среда Schneider с 10 процента фетален говежди серум при 37 C и 5 процента CO2. Еднодневните култури се състоят предимно от разпръснати делящи се клетки. Петдневните култури, с около 10 на 8-ма степен колониеобразуващи единици на mL, се приемат за стационарна фаза и съдържат видими агрегати.

Анализът използва SYBR Green I с пропидиев йодид, калибриран спрямо смеси от живи клетки и клетки, убити с изопропанол. Тъй като метиленовото синьо е силно оцветено, положителните резултати са потвърдени чрез микроскопия, а след това чрез броене на колонии върху кръвен агар — по-строгия краен показател.

При скрининг на 1,581 одобрени лекарства при 50 микромолара метиленовото синьо оставя 16 процента жизнеспособни клетки според микроплаковия четец и 25 процента според микроскопията. За даптомицин резултатът е 21 процента, за няколко азола — 22 до 27 процента, за гентамицин — 32 процента, за еритромицин — 66 процента, а за ципрофлоксацин — 74 процента. Пирвиниевият памоат изглежда по-силен според четеца, но не може да бъде оценен чрез микроскопия заради собствената си флуоресценция.

Срещу растяща B. henselae MIC на метиленовото синьо е 0.08 до 0.16 микрограма на mL. При петдневни стационарни клетки и концентрация 5 микрограма на mL броят на колониите спада до липса на откриваеми колонии след един ден експозиция, както при даптомицин и пирвиниев памоат в изпитаните им концентрации. Отделен експеримент за проследяване на унищожаването във времето използва 10 микрограма на mL. Това са лабораторни нива на експозиция, а не дози, и публикацията ги представя именно така. Цитирана пикова плазмена стойност при хора около 3.9 микрограма на mL се появява в публикацията само като общ контекст. Прегледът на фармакокинетиката на метиленовото синьо обяснява защо плазмена стойност не може да се приема за тъканна стойност.

В публикацията изрично са посочени две ограничения. Няма модел на биофилм и няма изпитване на комбинации с метиленово синьо. Петдневните агрегати са струпвания в стационарна течна култура, а не валидиран експеримент с биофилм. Авторите призовават за изследвания върху животни, на комбинации, на биофилми и на други видове Bartonella.

Комбинации и клетки, получени от биофилм: Zheng и съавтори, 2020

Последващото изследване от 2020 г. в BMC Microbiology запазва същия щам и среда, но преминава към шестдневни стационарни култури и добавя две неща, които липсват в първата публикация: комбинации от две лекарства и модел с клетки, получени от биофилм.

При самостоятелно изпитване на лекарствата с еднаква концентрация 5 микрограма на mL за 24 часа метиленовото синьо оставя 3.2 по 10 на 4-та степен колониеобразуващи единици на mL при контролна стойност около 2.8 по 10 на 10-та степен. Ципрофлоксацинът, гентамицинът и нитрофурантоинът оставят по-малко колонии в същия момент. Това се различава от резултата през 2019 г., когато същата номинална концентрация води до липса на откриваеми колонии след един ден. Възрастта, плътността и обработката на културите се различават, така че унищожаването е възпроизводимо по посока, но не е еднакво по мащаб. Тази промяна между отделните експерименти е една от причините стандартните проверки за безопасност и взаимодействия да разглеждат лабораторната активност отделно от клиничния ефект.

Скринингът на комбинациите е най-цитираната част. Всеки компонент е с фиксирана концентрация 5 микрограма на mL. Както азитромицин плюс метиленово синьо, така и рифампицин плюс метиленово синьо водят до липса на откриваеми колонии в стационарна фаза след 24 часа, както и двете комбинации с ципрофлоксацин. Това са единствените четири такива резултата сред 25 изпитани двойки. Не е проведен формален анализ на синергията, затова правилният термин е активна комбинация при тези условия, а не доказана синергия.

Експериментът с биофилм изпитва клетки, извлечени от млад разрушен биофилм, а не проникване в непокътнат зрял биофилм. Културите са отглеждани пет дни, разредени в микроплаки за още пет дни, потвърдени чрез оцветяване с кристалвиолет и след това изстъргани преди експозицията на лекарствата. При 5 микрограма на mL самостоятелното метиленово синьо намалява броя до 2.3 по 10 на 2-ра степен към ден 6 — сред най-добрите резултати за самостоятелни средства, но не до нула. И двете комбинации с метиленово синьо достигат нула към ден 6, както и двете комбинации с ципрофлоксацин.

Авторите посочват същите ограничения, които би забелязал внимателният читател: млад изстърган биофилм вместо стар непокътнат биофилм, една удобна концентрация за всички лекарства вместо реалистичната пикова концентрация на всяко от тях, само избрани двойки с азитромицин или рифампицин, един щам, без животни и без пациенти. Предложени са последващи изследвания с три лекарства, но не са съобщени резултати от тях.

Сравнение на дизайна на изследванията

Таблицата представя накратко основната идея на тази статия. Всичко вляво от последната колона е работа с култури. Нищо в нито една от двете публикации не попада в последната колона.

Bartonella не е Borrelia

И двете публикации споменават Borrelia burgdorferi, спирохетата, причиняваща Лаймска болест, защото анализът с багрила произлиза от по-ранни изследвания на Borrelia в стационарна фаза в същата лаборатория, където метиленовото синьо и даптомицинът също са показали активност. Тази предистория дава полезен контекст, но често е и източник на грешки.

Нито един експеримент в двете публикации за Bartonella не изпитва Borrelia успоредно с Bartonella. Организмите, средите и концентрациите се различават, а предполагаемото действие на метиленовото синьо върху мембраната на Bartonella е представено като хипотеза, която изисква допълнително проучване. Резултатите не бива да се пренасят от един вид към друг и нито една от публикациите не подкрепя широки твърдения за паразити. Именно по тази причина сравнението на персистиращите клетки на Borrelia и Bartonella разглежда двете групи публикации отделно.

Защо резултатите от култури не се превръщат в протокол

Интересът към търсене на протокол с метиленово синьо за Bartonella е разбираем. Тези публикации показват защо подобна фраза трябва да се приема като предупредителен сигнал, а не като списък за покупки.

Първо, 5 микрограма на mL в ямка на микроплака не е предписание. Към тази стойност няма данни за абсорбция, разпределение, свързване с белтъци, вътреклетъчно проникване или поносимост. Авторите я избират като приблизителна средна стойност на пиковите концентрации на антибиотици и посочват, че бъдещите изследвания трябва да използват реалистичната концентрация на всяко лекарство.

Второ, нула колонии означава липса на колонии при съответните условия на посявка, а не стерилна тъкан. Персистиращите клетки, вътреклетъчните бактерии и ограниченията на пробовземането остават извън агаровата плака.

Трето, комбинации, които стерилизират ямка, могат да се окажат неуспешни или вредни в организма. Азитромицин плюс метиленово синьо и рифампицин плюс метиленово синьо са лабораторни двойки при лабораторни експозиции. Без фармакокинетични изследвания върху животни и контролирани данни при хора няма установени доза, продължителност или съотношение полза–риск. Всеки, който обмисля възможностите, трябва да ги обсъди с лекар и да прегледа кога употребата на метиленово синьо изисква медицинско наблюдение, преди да прави каквито и да било заключения от данни от съдове за култивиране.

Тесният извод, който тези публикации действително подкрепят, е следният: метиленовото синьо има възпроизводима активност срещу нерастяща B. henselae JK53 in vitro, включително в лабораторни комбинации от две лекарства, като най-силните резултати за комбинации и за клетки от биофилм идват от изследването от 2020 г. Всичко останало, включително дали тази активност има значение за бартонелозата при хора, остава неизпитано.