Абсорбционен спектър и моларен коефициент на поглъщане на метиленовото синьо: справочник с посочени условия

Спектърът на метиленовото синьо изглежда прост, докато не се опитате да използвате повторно числена стойност от него. Една лаборатория съобщава моларен коефициент на екстинкция около 82,000. Друга съобщава 67,000. Трета — над 100,000. И трите стойности могат правилно да описват съответните измервания, но нито една не е универсална константа за багрилото.

Объркването идва от смесването на две различни понятия. Абсорбансът е измерена величина за конкретен разтвор в конкретна кювета. Моларният коефициент на поглъщане, често означаван с епсилон, е параметър в модел на този разтвор. Когато метиленовото синьо променя състоянието си на асоциация, моделът се променя, а с него се променя и параметърът. Полезен навик е всеки коефициент да се разглежда като стойност с посочени условия: дължината на вълната, разтворителят, pH или буферът, температурата, концентрационният диапазон и дължината на оптичния път трябва да съпътстват числото.

Мономерната ивица в разреден воден разтвор

В разреден воден разтвор доминиращата ивица на катиона на метиленовото синьо е близо до 664 до 665 nm, като често се посочват стойности в диапазона 664 до 668 nm в зависимост от апаратурата и избора на калибриране. Тази ивица е подходящият избор за количествено определяне, когато разтворът е достатъчно разреден, така че по-голямата част от багрилото да е в мономерна форма.

Три литературни стойности показват защо условията са по-важни от самото число. Изследователи на глини, които са поддържали концентрацията на водните проби под около 7 микромолара в кювети с оптичен път 1 cm, съобщават епсилон около 82,000 M-1 cm-1 при 665 nm. Тази стойност е необичайно добре документирана като емпиричен наклон на калибрационната права за силно разредени водни проби. По-късно първично калибриране в дейонизирана вода, при концентрации от 2.34 до 37.52 микромолара и оптичен път 1 cm, дава около 67,100 M-1 cm-1 при 665 nm за общото количество багрило. По-ниският резултат е очакван, а не противоречив, защото в горната половина на този калибрационен диапазон вече има значително количество димер. Трета стойност, около 73,460 M-1 cm-1 при 664 nm, произлиза от изследване при pH 6.86 и 293 K, в което наблюдаваният спектър е разделен на мономерна и димерна съставка, както е обобщено в скорошен критичен обзор на фотофизиката на метиленовото синьо. Това число се отнася до мономерен компонент, отделен чрез деконволюция, а не до пряк наклон на зависимостта на абсорбанса от общата концентрация на багрилото.

Практическият извод: изберете коефициента, чиито условия съответстват на вашите проби, или направете собствено калибриране. Не използвайте 82,000 за анализ в 30-микромоларен фосфатен буфер и не приемайте, че линейността все още е валидна.

Рамото при по-къси дължини на вълната е смесен сигнал

С нарастването на концентрацията рамото близо до 600 до 615 nm се усилва спрямо пика при 664 nm. Съвременните изследвания обикновено поставят приноса на димера от H-тип близо до 605 до 610 nm. Глобалният спектрален анализ на метиленовото синьо във вода разделя димерен максимум при 607 nm и максимум на агрегат от по-висок порядък при 600 nm, с мономерни резонансни компоненти при 664 и 650 nm. Пълният текст е достъпен чрез записа с отворен достъп за PMID 33251415.

Това рамо не бива да се означава като абсорбанс само на димера. Вибронната структура на мономера също има принос в същата област, така че измерената височина е суперпозиция. При едно глобално напасване е установено, че модел само с мономер и димер не описва целия диапазон от 1.1 микромолара до 3.4 милимолара, докато добавянето на тетрамер дава най-доброто напасване, като тетрамерният сигнал е откриваем още под 34 микромолара. Получените при напасването коефициенти за компонентите са високи: около 107,800 M-1 cm-1 при 664 nm за основния мономерен компонент, около 101,400 за димера при 607 nm и около 138,500 за тетрамера при 600 nm, в небуферирана дейонизирана вода с натриев хлорид от 0 до 0.15 M и температури от 282 до 333 K. Това са компоненти, разделени чрез модел, така че не бива да заместват емпиричния наклон по закона на Бугер–Ламберт–Бер.

Степента на димеризация е количествено определена пряко. При pH 6.86 и 293 K едно изследване получава константа на димеризация близо до 3,900 M-1. Тази величина обяснява защо 5-микромоларен работен разтвор се държи почти линейно, докато 50-микромоларен изходен разтвор не се държи така. Полезна проверка при разработването на метод е отношението на абсорбанса близо до 610 nm към абсорбанса близо до 665 nm. Когато това отношение се увеличава с концентрацията, епсилон при 664 nm вече не описва една неизменна химична форма.

В концентрационен интервал, доминиран от една двойка взаимопревръщащи се форми, спектрите могат да имат обща изосбестична точка, експериментално близо до 625 nm във водни серии. Ясна неподвижна точка е съвместима с наличието на две доминиращи форми. Когато точката се измества или изчезва с нарастването на концентрацията, приемете това като предупреждение за появата на агрегати от по-висок порядък или за изместване на равновесията, а не като инструментална грешка.

Разтворителят, pH и температурата изместват спектъра

Водата благоприятства асоциацията. Добавянето на диметилсулфоксид потиска димеризацията, измества максимумите на поглъщане и флуоресценция към по-дълги вълни и увеличава квантовия добив на флуоресценция около четири пъти според изследването на влиянието на разтворителя върху метиленовото синьо в смеси от вода и DMSO, индексирано като PMID 30933781. Това изследване разглежда водните спектри като равновесие между мономер и димер, с поглъщане на мономера близо до 650 до 670 nm и на димера близо до 580 до 615 nm, и извежда константи на димеризация от спектрите при 293.15 K.

Алкохолите променят както положението, така и привидния интензитет, но не премахват агрегацията. В едно първично сравнение при 31.3 микромолара и стайна температура, описано в изследване на метиленовото синьо в различни разтворители, максимумът при по-дълги вълни е 665 nm във вода, но 655 nm в метанол, с привидни стойности за целия разтвор близо до 37,100 във вода и 60,800 в метанол. Отделно валидиране в абсолютен етанол при 298 K дава максимум при 655 nm с епсилон близо до 68,000.

Обичайните промени в pH изместват спектъра по-малко, отколкото предполагат много протоколи. Цитираният по-горе критичен обзор съобщава, че от около pH 2 до pH 12 максимумът остава близо до 665 nm, с едва малки промени в интензитета до pH 11. Видът на буфера и йонната сила могат да променят резултатите толкова, колкото и номиналното pH, затова записвайте действително използваните буфер и сол, а не само показанието на pH-метъра. Силно киселата или силно алкалната среда е отделен случай, защото багрилото може да претърпи химична промяна вместо обратима асоциация. Температурата и солта също изместват равновесието, поради което изследването във вода от 2020 г. целенасочено променя и двете.

Измерване, при което стойността остава валидна

Количествената работа се основава на закона на Бугер–Ламберт–Бер: абсорбансът е равен на епсилон, умножен по концентрацията и по дължината на оптичния път, заедно с доказателство, че линейният интервал действително е валиден при вашите условия.

Използвайте кювета с оптичен път 1 cm за работа при ниски микромоларни концентрации. При епсилон близо до 82,000 концентрация от 5 микромолара дава абсорбанс близо до 0.41, а 10 микромолара — около 0.82. За измерване, насочено към мономера в чиста вода, е по-сигурно да се поддържат концентрации близо до или под приблизително 5 до 7 микромолара, отколкото калибрирането да се разширява значително в диапазона на десетки микромолари. За концентрирани изходни разтвори скъсете оптичния път, вместо да приемате абсорбанс далеч над 1.

Използвайте празна проба с идентична матрица: същия клас вода, същия дял на съразтворителя, същия буфер и соли, но без багрило. Пригответе калибрационните разтвори в същата матрица и при същата температура. При разработването на метода сканирайте целия видим диапазон, в идеалния случай около 550 до 750 nm, вместо да измервате само при една дължина на вълната. Следете формата, а не само височината. Ако последователното разреждане променя нормализираната форма, химичното състояние на системата зависи от концентрацията. Стабилният максимум и стабилното отношение на абсорбансите при 610 и 665 nm са по-силно доказателство за приемлив диапазон, отколкото само висока стойност на R на квадрат.

Документирайте формата на реагента. Търговският материал може да бъде безводен метилтиониниев хлорид или хидрат, например трихидрат, така че моларната маса, използвана за изчисленията на изходния разтвор, трябва да съответства на действителното съдържание на бутилката. Само тази стъпка обяснява част от разминаванията между номиналните моларни концентрации в различни лаборатории. Същата дисциплина е необходима, когато резултатите се използват в изчисления за количествени анализи, когато спектрите подпомагат проверките за стабилност на формулации и когато профилите на примесите изискват преглед на чистотата и спецификациите.

Обобщение с посочени условия

Използвайте тази таблица като начален шаблон за лабораторен запис, а не като източник на взаимозаменяеми константи.

Следователно дължината на вълната на поглъщане на метиленовото синьо е кратък отговор с дълга бележка под линия. Посочвайте измерения пик, разтвора, в който сте го измерили, и концентрацията, при която сте го измерили. Този навик не позволява една стойност за разреден воден разтвор близо до 664 nm да се превърне в погрешна универсална константа.