EMB агар срещу MacConkey агар: избор и интерпретация на среди

Студент посява една и съща водна проба чрез щриховане върху две плаки. Върху едната се появяват тъмни колонии със зелен метален блясък. Върху другата се появяват яркорозови колонии с мътен ореол. И двете плаки са инокулирани от една и съща епруветка, инкубирани една до друга и отчетени по едно и също време. Студентът пита коя плака показва правилния резултат.

И двете плаки показват правилен резултат. Те отговарят на различни въпроси. Объркването възниква, когато двете среди се третират като взаимозаменяеми скринингови среди за чревни бактерии. Те имат обща цел — да селектират Грам-отрицателни ентерични организми и да разграничават ферментиращите лактоза от неферментиращите — но постигат тази цел чрез различна химия и различна визуална логика. След като разберете двете основни концепции, изборът на плака и разчитането на колониите стават рутинни.

Краткият отговор

EMB агарът използва две багрила, еозин Y и метиленово синьо, които изпълняват двойна функция: потискат растежа на Грам-положителни организми и се утаяват около силните продуценти на киселини, образувайки тъмни колонии, класически със зелен метален блясък при Escherichia coli. MacConkey агарът разделя функциите: жлъчните соли плюс кристалвиолетът потискат Грам-положителните организми, лактозата служи като субстрат за ферментация, а неутралното червено показва образуването на киселина чрез розови или червени колонии. Ако задачата е ярка предполагаема демонстрация на E. coli, EMB има своето място. Ако задачата е ясно разграничаване на розови от безцветни колонии при ферментиращи и неферментиращи лактоза организми, особено при работни процеси с фекални проби или урина, MacConkey обикновено се разчита по-лесно. Нито една от двете плаки не идентифицира организъм само по цвета.

EMB: багрила, които едновременно селектират и показват резултата

Концепцията на EMB обединява селекцията и индикацията в едни и същи молекули. Протоколът на ASM за агар с еозин и метиленово синьо описва EMB като едновременно селективна и диференциална среда, при която двойката багрила потиска много Грам-положителни организми, докато ферментацията на лактоза предизвиква натрупване и утаяване на багрилата. Стандартната формула на Levine съдържа пептон, лактоза, фосфат, еозин Y, метиленово синьо и агар, както е посочено в метода на FDA BAM за Levine EMB агар. Имайте предвид, че в някои по-стари рецептури за EMB към лактозата се добавя и захароза, докато Levine EMB съдържа лактоза без захароза, затова записвайте коя формула се използва във вашата лаборатория.

Разчитането на EMB означава да се наблюдава поведението на багрилата. Интензивната ферментация на лактоза образува достатъчно киселина, за да предизвика силно утаяване на багрилата, което придава на E. coli тъмносиньо-черни центрове и, в класическия случай, зелен метален блясък при отразена светлина. По-слабите ферментатори като Enterobacter и Klebsiella обикновено растат като розови до виолетови мукоидни колонии без такъв блясък. Неферментатори като Salmonella, Shigella и Proteus обикновено растат като безцветни или полупрозрачни колонии, тъй като не предизвикват резкия прилив на киселина, необходим за утаяване на багрилата. Грам-положителните организми обикновено се потискат, макар че степента на потискане варира според щама и продукта. Подробната химия на приготвянето на багрилата, включително защо метиленовото синьо се държи като катионно багрило, принадлежи към отделно обсъждане на формулите на багрилата, а общият контекст на микроскопията е представен в атлас на методите за оцветяване. Тази статия е фокусирана върху избора на плаки и разчитането им.

Фигурата по-горе е илюстративна. Тя показва очакваната визуална логика: тъмни колонии с блясък, розови мукоидни типове и бледи типове върху EMB, в сравнение с розови и бледи типове върху MacConkey. Използвайте я, за да усвоите модела, след което потвърждавайте всяка интерпретация спрямо фотографирани контроли и продуктовата инструкция за конкретната среда, използвана на работното ви място.

MacConkey: разделени функции, по-просто визуално правило

Концепцията на MacConkey възлага всяка функция на отделна съставка. Протоколът на ASM за MacConkey агар представя същата селективна и диференциална рамка, а методът на FDA BAM за MacConkey агар изброява работните компоненти: пептони, лактоза, жлъчни соли, сол, неутрално червено, кристалвиолет и агар. Жлъчните соли плюс кристалвиолетът селектират срещу Грам-положителни организми. Лактозата осигурява субстрата за ферментация. Неутралното червено действа като индикатор на pH и става розово до червено там, където се образува киселина, понякога с утаена жлъчка около силните ферментатори.

Правилото за разчитане умишлено е просто: розово означава ферментация на лактоза, а безцветно или бледо означава липса на ферментация. E. coli изглежда розова до червена, често с ореол от жлъчна утайка. Klebsiella и Enterobacter изглеждат розови и често мукоидни заради капсулите си. Salmonella, Shigella, Proteus и много други Грам-отрицателни пръчици изглеждат безцветни. Има и допълнително предимство, важно в учебните лаборатории: жлъчните соли обикновено намаляват роенето на Proteus, така че изолирани колонии се получават по-лесно върху MacConkey, отколкото върху неселективни среди, въпреки че потискането не е абсолютно и съществуват алтернативи без сол, когато контролът на роенето е основният приоритет.

Молекулната причина багрилата да се държат по този начин е свързана със заряда и структурата. Метиленовото синьо е катионно фенотиазиново багрило, чиито структура и свойства обясняват афинитета му към киселинните бактериални повърхности — същият афинитет участва и при утаяването му в киселинните зони върху EMB.

Сравнение с един поглед

Разглеждайте таблицата като процедура за вземане на решение. Когато упражнението изисква студентите да видят градация в силата на ферментацията с един ясно изразен краен резултат, EMB я показва. Когато упражнението изисква бързо двоично разграничаване преди биохимично потвърждение, MacConkey го показва.

Коя среда за коя проба

При упражнения с вода, насочени към предполагаемо разпознаване на фекални колиформи или E. coli, EMB е привлекателен избор, защото блясъкът е визуално отличителен. MacConkey също е подходящ за ентерични Грам-отрицателни организми и исторически е използван при изследване на вода, но нито една от двете плаки не замества регулаторен метод за изследване на вода, който може да изисква среди като модифициран mTEC или MI в зависимост от теста. Проверете метода, който вашата лаборатория е длъжна да следва.

За разделяне на ферментатори от неферментатори при проби от типа на фекални материали MacConkey обикновено е по-полезната от двете среди. Практическата работа с фекални проби за Salmonella или Shigella обикновено включва и по-селективни ентерични среди като XLD или Hektoen enteric, вместо да разчита само на MacConkey.

При учебна работа с урина, която имитира клиничен работен процес, комбинирайте MacConkey с кръвен агар. MacConkey осигурява ранното разграничаване на Грам-отрицателните организми, докато кръвният агар позволява растежа на организми, които MacConkey потиска. Тази комбинация е стандартна в клиничните описания на подготовката на уринни култури.

За преподаване на самата концепция използвайте и двете. EMB показва, че силата на ферментацията има значение и че една молекула може да изпълнява две функции. MacConkey показва модулен дизайн: селекторът, субстратът и индикаторът са разделени. Студенти, които посяват чрез щриховане известен E. coli, известен Klebsiella aerogenes и известен Salmonella един до друг върху двете среди, рядко объркват отново двете логики.

Повтарящи се капани при разчитането

Най-честата грешка е идентифицирането само по цвят. Розовото върху MacConkey може да бъде E. coli, Klebsiella, Enterobacter или друг ферментатор. Безцветното може да бъде Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas или друг неферментатор. Цветът е скринингов фенотип, който насочва към потвърдителна работа като оцветяване по Gram, оксидазен тест, биохимични панели или инструментална идентификация, а не към конкретно име на вид.

Втората грешка е прекомерното значение, придавано на липсващия блясък. Някои действителни колонии на E. coli, особено изолираните, образуват слаб или никакъв метален блясък върху EMB. Липсата на блясък не изключва E. coli, а наличието му не го доказва. Приемайте блясъка като предполагаема насока.

Третата грешка е сравняването на плаки с различна възраст. Забавените ферментатори на лактоза могат да станат розови върху MacConkey след продължителна инкубация, което размива ясното разделение между ферментатори и неферментатори. Отчитайте в определения от лабораторията час и записвайте времето на инкубация заедно с резултата.

Четвъртата грешка е смесеният растеж да се разчита като един организъм. Розова колония до безцветна колония означава два фенотипа, а не междинен фенотип. Избирайте добре изолирани колонии и работете с всеки морфотип поотделно. Мукоидната текстура създава подобен капан: както Klebsiella, така и Enterobacter могат да изглеждат мукоидни, затова само капсулата никога не е достатъчна за определяне на името. Организмът, който преди се е преподавал като Enterobacter aerogenes, сега се класифицира като Klebsiella aerogenes, което обяснява защо по-старите таблици и по-новите етикети изглеждат противоречиви.

Контроли и заключително правило

Използвайте фотографирани или пресни контроли при всяка сесия: E. coli за реакцията на силен ферментатор, Klebsiella aerogenes за мукоидна ферментация без класическия блясък, щам Salmonella за безцветната реакция на неферментатор и Staphylococcus aureus за потвърждаване на потискането на Грам-положителни организми при конкретния ви продукт. Съобразявайте номерата на щамовете и критериите за приемане с инструкцията на производителя, тъй като селективността се променя според съдържанието на жлъчка, кристалвиолет и багрила.

Запомнете едно изречение при работа на лабораторната маса. EMB използва багрила, които едновременно селектират и показват резултата, което осигурява силно изразен сигнал за E. coli за сметка на по-фина интерпретация. MacConkey разделя селекцията от индикацията, което осигурява ясно разграничаване между розови и бледи колонии за сметка на по-малко подробности за ферментацията. Изберете средата, чиято концепция съответства на въпроса, потвърдете цвета с подходящи тестове и двете плаки престават да се конкурират и започват да се допълват.