Вымярэнне актыўных формаў кіслароду ў эксперыментах з метыленавым сінім

Дзве лабараторыі праводзяць тое, што кожная называе эксперыментам па вывучэнні антыаксідантнага дзеяння метыленавага сіняга. Адна паведамляе, што фарбавальнік зніжае ўтварэнне актыўных формаў кіслароду. Другая паведамляе, што ён іх утварае. Абедзве дэманструюць выразныя крывыя залежнасці эфекту ад дозы. Абедзве шчырыя. Прычына адрознення — не махлярства і не некампетэнтнасць. Проста дзве групы вымяралі розныя рэчы пры розным асвятленні, выкарыстоўваючы зонды, якія адказваюць на розныя пытанні, а потым апісалі абодва вынікі адным словам: ROS.

Метыленавы сіні — малекула, якую цяжка дакладна даследаваць, бо яна ўдзельнічае ў хімічных працэсах, за якімі нібыта павінна толькі назіраць. У цемры яна пераносіць электроны паміж донарамі і акцэптарамі і вяртаецца ў зыходную форму, гатовая да наступнага цыкла. На святле яна становіцца фотасенсібілізатарам і пераходзіць ва ўзбуджаны трыплетны стан, з якога можа перадаваць энергію кіслароду з утварэннем сінглетнага кіслароду або пераносіць электроны з утварэннем радыкалаў і пераксіду вадароду. Любы зонд, уведзены ў такую сістэму, можа акісляцца, аднаўляцца, абясколервацца або аптычна маскіравацца самім фарбавальнікам. Таму першае пытанне пры любым вымярэнні ROS — не тое, якое атрымалася значэнне. Спачатку трэба высветліць, што насамрэч выяўляе аналіз і як фарбавальнік уплывае на яго.

Amplex Red: калібраваны аналіз пераксіду вадароду

Спалучэнне метыленавага сіняга і Amplex Red — найбольш абгрунтаваная пара ў гэтай літаратуры, калі эксперымент арганізаваны правільна. Хімічны механізм спецыфічны: пероксидаза хрэну выкарыстоўвае пераксід вадароду, каб акісліць субстрат Amplex да флуарэсцэнтнага прадукту, рэзаруфіну, са стэхіяметрыяй прыкладна адзін да аднаго. Пераксід ва ўзоры ператвараецца ў флуарэсцэнцыю, якую рэгіструе дэтэктар. Ніводная іншая форма з класічнага набору ROS непасрэдна не выклікае гэтай рэакцыі.

Вырашальная перавага — каліброўка. Уважлівы даследчык аналізуе стандарты з вядомай колькасцю пераксіду ў тым жа буферы, з тымі ж канцэнтрацыямі пероксидазы і субстрату, тым жа часам інкубацыі і тымі ж аптычнымі наладамі, а потым вызначае значэнні для ўзораў паводле атрыманай крывой. У даследаванні ізаляваных мітахондрый мозгу, якое служыць асновай гэтага метаду, аўтары зрабілі менавіта так: у канцы кожнага вымярэння яны дадавалі вядомыя колькасці пераксіду, а вынікі падавалі як хуткасці ў пікамолях за хвіліну на міліграм бялку, а не ва ўмоўных адзінках флуарэсцэнцыі. Менавіта гэта ператварае свячэнне ў вымярэнне.

Тры дэталі гэтага даследавання варта пераняць. Па-першае, аўтары праверылі сігнал з дапамогай каталазы, якая разбурае пераксід. Выкліканае метыленавым сінім нарастанне флуарэсцэнцыі спынялася пасля дадання каталазы, што пацвярджала: сігнал быў звязаны з пераксідам, а не з аптычным артэфактам. Па-другое, яны непасрэдна праверылі ўплыў асвятлення, перакрываючы прамень узбуджэння засаўкай так, каб узоры атрымлівалі адну восьмую звычайнай дозы святла, і сігнал знізіўся толькі на дзевяць працэнтаў. Больш за дзевяноста працэнтаў зарэгістраванага імі пераксіду ўтваралася незалежна ад святла, выкарыстанага пры вымярэнні. Па-трэцяе, яны асобна вымералі выдаленне пераксіду з дапамогай электрода і выявілі, што фарбавальнік адначасова павялічваў яго ўтварэнне і запавольваў выдаленне. Зонд, які рэгіструе толькі выніковую флуарэсцэнцыю, змяшаў бы гэтыя два эфекты.

У гэтага аналізу ўсё ж ёсць крыніцы памылак, і метыленавы сіні задзейнічае некалькі з іх. Фарбавальнік паглынае святло ў шырокай вобласці таго ж чырвонага дыяпазону, у якім выпраменьвае рэзаруфін, таму пры высокіх канцэнтрацыях фарбавальніка ўзор можа маскіраваць уласны сігнал праз эфекты ўнутранага фільтра. Таму стандарты павінны змяшчаць тую ж канцэнтрацыю фарбавальніка, што і ўзоры. Amplex Red таксама можа фотаакісляцца сам па сабе, а яго прадукт рэзаруфін можа ўдзельнічаць у фотарэдакс-цыклах, якія ўтвараюць супераксід і пераксід. Гэта асабліва істотна, калі ў эксперыменце адначасова асвятляюць фотасенсібілізатар. Практычнае рашэнне — спачатку апрамяняць узоры з метыленавым сінім, а затым аналізаваць аліквоты з рэагентамі Amplex у цемры, замест таго каб асвятляць фарбавальнік і зонд разам. Нарэшце, супераксіддысмутаза не проста зніжае сігнал Amplex: ператварэнне супераксіду ў пераксід можа яго павялічыць. Кантроль з SOD, які павялічвае флуарэсцэнцыю, не з'яўляецца няўдалым. Ён паказвае, што супераксід удзельнічае ў папярэднім этапе рэакцыйнага ланцуга.

DCFDA: неспецыфічны індыкатар акіслення

Спалучэнне метыленавага сіняга і DCFDA — крыніца большасці непаразуменняў. DCFH-DA — папярэднік, які ўводзяць у клеткі. Эстэразы ўнутры клеткі адшчапляюць яго ацэтатныя групы, пакідаючы нефлуарэсцэнтны DCFH, а акісленне DCFH дае флуарэсцэнтны DCF. Спіс рэчываў, якія яго акісляюць, доўгі: гідраксільныя радыкалы, прамежкавыя прадукты пероксидазных і гемавых рэакцый, дыяксід азоту, хларнавацістая кіслата і радыкалы, утвораныя з пераксінітрыту. Сам па сабе пераксід вадароду не акісляе яго непасрэдна з практычна значнай хуткасцю; флуарэсцэнцыя, залежная ад пераксіду, звычайна патрабуе ўдзелу жалеза, гемавых бялкоў або пероксидазных рэакцый.

Крытычны разбор, на які варта спасылацца ў кожным раздзеле метадаў, паходзіць з аналізу DCFH як зонда, праведзенага Kalyanaraman і калегамі і выкладзенага ў даследаванні мітахондрый мозгу, у якім з гэтай прычыны адмовіліся ад DCFDA. Яны паказалі, што фарбавальнік рэагуе павольна, з невызначанай стэхіяметрыяй, без карэктнай каліброўкі і з рэчывамі, якія не належаць да ROS. Зонд таксама ўзмацняе тое, што вымярае: аднаэлектроннае акісленне DCFH утварае радыкал DCF, які рэагуе з кіслародам з утварэннем супераксіду, а той дысмутуе з утварэннем дадатковага пераксіду. Вымярэнне часткова само стварае хімічныя працэсы, пра якія паведамляе.

Усё гэта не робіць DCFDA бескарысным. Гэта робіць яго інструментам скрынінгу, а не ідэнтыфікацыі. Рост флуарэсцэнцыі DCF азначае, што ўзмацнілася залежнае ад акісляльнікаў акісленне зонда. Ён не азначае, што павялічылася колькасць пераксіду, і ўжо дакладна не азначае, што павялічылася агульная колькасць ROS — велічыня, якую не вымярае ніводзін асобны зонд. Ранейшыя працы з метыленавым сінім, якія абапіраліся на акісленне DCF пры канцэнтрацыях вышэй за адзін мікрамоль на літр, паведамлялі пра прааксідантныя эфекты, тады як іншыя сістэмы ў той жа перыяд паказвалі абарону ад гібелі клетак, выкліканай пераксідам. Абодва назіранні могуць быць справядлівымі для аднаго і таго ж фарбавальніка ў розных акісляльна-аднаўленчых умовах, а сам па сабе вынік DCF не дазваляе вызначыць, які акісляльнік абумовіў сігнал. Значэнне ранейшай працы з мітахондрыямі мозгу ў тым, што яна замяніла гэты скрынінг калібраваным вымярэннем пераксіду і непасрэдна выявіла яго павелічэнне: нават сто нанамоляў фарбавальніка на літр павялічвалі вылучэнне пераксіду ў некалькі разоў пры ўсіх правераных субстратах і станах дыхання.

У DCFDA ёсць яшчэ адна пастка, спецыфічная для метыленавага сіняга. Фарбавальнік інтэнсіўна афарбаваны і акісляльна-аднаўленча актыўны, таму ён можа выклікаць абясколерванне флуарэсцэнтнага прадукту, тушыць выпраменьванне або акісляць зонд незалежна ад клеткавых ROS. Бясклетачны кантроль з фарбавальнікам і зондам, але без клетак — не неабавязковае ўпрыгожанне. Гэта эксперымент, які паказвае, ці ўзаемадзейнічае фарбавальнік з зондам.

Спінавыя пасткі і паглынанне кіслароду: ідэнтыфікацыя і паток

Калі флуарэсцэнтныя зонды паказваюць, што з'явілася нешта, здольнае акісляць, то электронны спінавы рэзананс са спінавымі пасткамі дае больш дакладнае ўяўленне пра тое, што гэта было. У класічным даследаванні фотахіміі метыленавага сіняга выкарыстоўвалі ESR для выяўлення аскарбатнага радыкала, утворанага пры ўдзеле фарбавальніка, аскарбату і святла, а затым паказалі ўтварэнне пераксіду ў эксперыментах з паглынаннем кіслароду і каталізаванае жалезам утварэнне гідраксільнага радыкала ў эксперыментах са спінавымі пасткамі. Кожны метад адказваў на пытанне, на якое не маглі адказаць іншыя: ESR вызначаў, які менавіта радыкал прысутнічае, паглынанне кіслароду паказвала паток рэакцыі незалежна ад любога флуарэсцэнтнага зонда, а іх спалучэнне выявіла, што ў адной і той жа асветленай сістэме дзейнічалі як сінглетна-кіслародны, так і радыкальны шляхі.

Гэты вынік 1984 года і цяпер успрымаецца як папярэджанне. Пры асвятленні і наяўнасці аднаўляльніка фарбавальнік утвараў пераксід, а пры наяўнасці жалеза сістэма ўтварала гідраксільны радыкал — найбольш рэакцыйназдольную форму ў гэтым наборы. Аўтары звязалі гэта з аскарбатам у воку і паставілі пад сумнеў неабдуманае афтальмалагічнае выкарыстанне. Сучасным чытачам варта звярнуць увагу на ўмовы: святло плюс аднаўляльнік плюс жалеза. Прыбярыце любы з гэтых кампанентаў, і шлях аслабне або знікне.

Кіслародныя электроды карысныя па іншай прычыне. Электрод тыпу Кларка вымярае сумарнае спажыванне кіслароду, што пацвярджае: акісляльна-аднаўленчыя працэсы з удзелам фарбавальніка спажываюць малекулярны кісларод. Ён таксама дае кінетычныя даныя, якія немагчыма імітаваць флуарэсцэнтным артэфактам. Але ён не ідэнтыфікуе прадукт. Утварэнне пераксіду, супераксіду і вады, а таксама распад сінглетнага кіслароду — усе гэтыя працэсы спажываюць кісларод. Паток без ідэнтыфікацыі такі ж няпоўны, як ідэнтыфікацыя без патоку, таму ў пераканаўчых працах электрод спалучаюць з калібраваным аналізам пераксіду або пасткай.

Чаму вынікі адносна антыаксідантнага дзеяння супярэчаць адзін аднаму

Калі паставіць тры віды вымярэння побач, уяўныя супярэчнасці ў літаратуры пра метыленавы сіні зводзяцца да адрозненняў у метадах і трох біялагічных фактаў.

Па-першае, фарбавальнік адначасова пераносіць электроны і служыць крыніцай пераксіду. Адводзячы электроны ад участкаў дыхальнага ланцуга, дзе кісларод інакш ператвараўся б у супераксід, ён можа зніжаць колькасць адной формы ROS, а яго адноўленая форма пры гэтым непасрэдна аднаўляе кісларод да пераксіду, павялічваючы колькасць іншай. Таму лабараторыі, якая даследуе мітахандрыяльныя акісляльна-аднаўленчыя працэсы і ролю фарбавальніка як абыходнага шляху, варта чакаць вынікаў, залежных ад зонда: у той жа кювеце сігнал, адчувальны да супераксіду, зніжаецца, а сігнал пераксіду расце.

Па-другое, пераксід у малых дозах — гэта сігнал, а не толькі крыніца пашкоджання. Даследаванне мітахондрый мозгу мышэй, якое працягнула ранейшую працу, выявіла утварэнне пераксіду ўжо пры пяцідзесяці нанамолях фарбавальніка на літр без пашкоджанняў мітахандрыяльнай ДНК пры тэрапеўтычных канцэнтрацыях, а таксама абарону ад пашкоджанняў, выкліканых ратэнонам, пасля папярэдняй апрацоўкі. Толькі пры ста мікрамолях на літр, значна вышэй за тэрапеўтычны дыяпазон, фарбавальнік пашкоджваў асобныя фрагменты ДНК, а чырвонае святло разам з дваццаццю мікрамолямі фарбавальніка на літр выклікала ўтварэнне сінглетнага кіслароду, які пашкоджваў усе правераныя фрагменты. Прапанаваны механізм — гарметычны: нязначнае ўтварэнне пераксіду запускае звязаныя з Nrf2 антыаксідантныя ахоўныя механізмы і мітахандрыяльны біягенез, таму кароткатэрміновы прааксідантны сігнал папярэднічае больш працягламу антыаксідантнаму выніку. Аналіз праз адну гадзіну і аналіз праз адны суткі могуць даваць розныя вынікі, таму што паміж імі змяніліся біялагічныя працэсы.

Па-трэцяе, святло вызначае нават тое, якая малекула прысутнічае. Асвятленне дэмэтылюе фарбавальнік з утварэннем Azure B і роднасных прадуктаў, а святла лямпы мікраскопа над чашкай дастаткова для яго фотасенсібілізуючага дзеяння. Эксперыменты ў цемры і пры асвятленні — гэта розныя эксперыменты, і раздзел кантролю асвятлення і працы з фарбавальнікам у любым пратаколе павінен улічваць гэта.

Мінімальны набор кантроляў і як ацэньваць любое сцвярджэнне

Параўнанне ніжэй — арыгінальны даведачны матэрыял для гэтага артыкула. Перш чым прымаць любы вынік вымярэння ROS з метыленавым сінім, праверце, які радок аўтары запоўнілі, а які прапусцілі.

Адсюль вынікае практычнае правіла інтэрпрэтацыі. Калібраваны Amplex з пероксидазай і праверкай каталазай дае звесткі пра пераксід. DCFDA дае звесткі пра неспецыфічнае акісленне зонда і нічога больш. Спінавыя пасткі з кантролямі, якія выкарыстоўваюць паглынальнікі радыкалаў, даюць звесткі пра тое, якія менавіта радыкалы прысутнічаюць. Паглынанне кіслароду дае звесткі пра паток. Сказ, які сцвярджае больш, чым можа пацвердзіць выкарыстаны аналіз, як бы ўпэўнена ён ні быў напісаны, — гэта сказ пра зонд, а не пра фарбавальнік. Звязаныя абмеркаванні залежнасці ад дозы і гарметычнага дыяпазону, мітахандрыяльнага патоку электронаў, перашкод пры аналізе афарбаваных узораў і артэфактаў асвятлення ў мікраскапіі развіваюць кожны з гэтых пунктаў, і кожны застаецца слушным пасля замены часовай спасылкі.