Новы метыленавы сіні і афарбоўванне рэтыкулацытаў: асобны фарбавальнік і метад для жывых клетак

Студэнт рыхтуецца да падліку рэтыкулацытаў, заказвае метыленавы сіні, змешвае яго з крывёй і амаль нічога не бачыць. Аднагрупнік выкарыстоўвае флакон з надпісам «новы метыленавы сіні» і атрымлівае выразныя сінія ніткі ў частцы эрытрацытаў. Першы студэнт мяркуе, што ў другім флаконе фарбавальнік больш свежы або больш канцэнтраваны. Ні тое, ні другое. Ён утрымлівае іншую малекулу.

Менавіта гэтая памылка ў разуменні паняццяў ляжыць у аснове большасці блытаніны ў гэтай галіне. Назва стварае ўражанне, што новы метыленавы сіні — гэта палепшаная партыя метыленавага сіняга. Хімія сведчыць пра іншае. Новы метыленавы сіні N — асобны фенатыязінавы фарбавальнік з уласным нумарам Colour Index, уласнай схемай замяшчэння і ўласнай стандартызаванай роляй у гематалогіі. Калі гэтае адрозненне становіцца зразумелым, астатнія аспекты метаду — чаму клеткі павінны быць жывымі падчас афарбоўвання, што лічыць рэтыкулацытам, якое месца займаюць цельцы Гейнца і калі выкарыстоўваецца брыльянтавы крэзілавы сіні — лёгка зразумець.

Кароткі адказ

Новы метыленавы сіні N, гематалагічны рэагент, звычайна ідэнтыфікуецца як Basic Blue 24 у запісе PubChem пра новы метыленавы сіні, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, формула C18H22ClN3S. Звычайны метыленавы сіні — гэта хларыд метылтыянінію, Basic Blue 9, у адпаведным запісе PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, формула C16H18ClN3S. У структуры новага метыленавага сіняга ёсць дзве метыльныя групы ў кольцы і этыламінавыя бакавыя групы там, дзе метыленавы сіні мае д dimетыламінавыя групы. Гэтае адрозненне змяняе паводзіны пры афарбоўванні. У гематалагічнай літаратуры звычайны метыленавы сіні апісваецца як адносна слабы фарбавальнік для рэтыкулацытаў, а новы метыленавы сіні — як фарбавальнік, што дае больш інтэнсіўную і раўнамерную афарбоўку; гэтае параўнанне абагульнена ў тэматычным раздзеле ScienceDirect пра новы метыленавы сіні.

Так, новы метыленавы сіні — суправітальны фарбавальнік. Суправітальнае афарбоўванне азначае афарбоўванне жывых клетак пасля іх выдалення з арганізма і да фіксацыі, як вызначана ў аглядзе NCBI пра прынцыпы суправітальнага афарбоўвання. І новы метыленавы сіні, і брыльянтавы крэзілавы сіні належаць да гэтай катэгорыі, а стандарт CLSI для рэтыкулацытаў непасрэдна разглядае новы метыленавы сіні як суправітальны фарбавальнік. Студэнты часам адносяць гэты метад да афарбоўвання фіксаваных мазкоў паводле Раманоўскага. Тут такая мадэль разумення не працуе. Калі спачатку правесці фіксацыю, метад перастае працаваць.

Для чытачоў, якія разбіраюцца ў падобных назвах фарбавальнікаў, артыкул метылавы сіні і метыленавы сіні разглядае іншую, больш істотную блытаніну паміж аніённым трыарылметанавым фарбавальнікам і катыённым сямействам фенатыязінаў. Агляд лабараторнага афарбоўвання паказвае месца суправітальных метадаў сярод метадаў працы з фіксаванымі мазкамі, а дапаможнік па марфалогіі клетак крыві тлумачыць, як ацэнка рэтыкулацытаў упісваецца ў больш шырокі дыферэнцыяльны аналіз.

Адна заўвага адносна каталогаў: існуе асобная форма новага метыленавага сіняга ў выглядзе падвойнай солі з хларыдам цынку пад CAS 6586-05-6. Таму ў раздзеле метадаў варта ўказваць солевую форму і пастаўшчыка, а не толькі агульнапрынятую назву.

Што насамрэч робіць суправітальнае афарбоўванне

Рэтыкулацыт — малады эрытрацыт, які страціў ядро, але захоўвае рэшткавую рыбасомную РНК. У неафарбаваным вільготным прэпараце гэтая РНК нябачная. Суправітальны фарбавальнік пранікае ў жывую клетку і асаджае або агрэгуе гэтую РНК у сінія гранулы і ніткі — сеткавата-ніткападобны матэрыял, які бачны пры алейнай імерсіі. Такім чынам, сетка — гэта прадукт афарбоўвання, а не загадзя сфармаваны каркас, які толькі чакае колеру. Менавіта таму параметры пратакола — канцэнтрацыя фарбавальніка, буфер, суадносіны крыві і фарбавальніка, тэмпература, час — гэтак жа важныя, як і назва фарбавальніка.

Практычны вынік — строгая паслядоўнасць дзеянняў: спачатку змяшаць кроў з антыкаагулянтам з фарбавальнікам, правесці інкубацыю, затым зрабіць мазкі і даследаваць іх без фіксацыі і дадатковага афарбоўвання. Фіксацыя перад афарбоўваннем або дадатковае афарбоўванне, якое хавае слаба бачныя ніткі, знішчае інфармацыю, ад якой залежыць падлік.

Рабочы пратакол для рэтыкулацытаў з новым метыленавым сінім

Адзінага ўніверсальнага складу няма, таму ўказвайце той, які выкарыстоўваўся. Тры дакументаваныя варыянты паказваюць дыяпазон падыходаў.

Класічная працэдура тыпу Брэхера выкарыстоўвае прыблізна 0.5 працэнта новага метыленавага сіняга з аксалатам калію, змешанага ў роўных аб'ёмах з добра перамешанай крывёй з EDTA, з інкубацыяй каля 10–15 хвілін пры пакаёвай тэмпературы. Пасля асцярожнага паўторнага перамешвання рыхтуюць тонкія клінападобныя мазкі, высушваюць на паветры і даследуюць без фіксацыі пад імерсійным аб'ектывам 100x. Працэдура падліку рэтыкулацытаў у NCBI апісвае гэты працэс і падліковую рамку, якая выкарыстоўваецца разам з ім.

Варыянт Дэйсі і Льюіса выкарыстоўвае 1.0 працэнта новага метыленавага сіняга ў цытратна-солевым растворы, які змешваюць з 2–4 аб'ёмамі крыві і вытрымліваюць пры 37 C на працягу 15–20 хвілін перад падрыхтоўкай мазкоў. У нядаўняй рэалізацыі гарманізацыі працэдуры CLSI H44 выкарыстоўвалі менш канцэнтраваны 0.1-працэнтны раствор у фасфатна-буферным солевым растворы пры pH 7.4, з інкубацыяй пры 20 C на працягу 10 хвілін і без фіксацыі, як паведамляецца ў даследаванні гарманізацыі NMB 2026 года.

Правілы падліку агульныя для ўсіх варыянтаў. Залічвайце клетку як рэтыкулацыт, калі яна змяшчае прынамсі дзве асобныя афарбаваныя ў сіні колер гранулы або сегменты нітак; гэта выключае адзінкавыя адклады фарбавальніка. У звычайнай працы падлічвайце прынамсі 1,000 эрытрацытаў і падавайце долю рэтыкулацытаў у працэнтах. Пры нізкай долі статыстыка патрабуе большай колькасці клетак. У аглядзе метадалогіі CLSI H44 адзначаецца, што пры долі рэтыкулацытаў каля 1 працэнта патрэбна прыкладна 4,400 клетак, каб давесці варыябельнасць падліку да 5 працэнтаў; гэта апісана ў аглядзе CLSI H44 на De Gruyter. Акулярны дыск Мілера робіць падлік вялікай колькасці клетак практычна магчымым. Фільтруйце фарбавальнік або рыхтуйце яго непасрэдна перад выкарыстаннем, бо асадак імітуе гранулярныя ўключэнні.

Цельцы Гейнца ў тым самым прэпараце

Той самы суправітальны мазок можа таксама паказваць цельцы Гейнца — агрэгаты акісленага і дэнатураванага гемаглабіну, а не рэшткавую РНК. У прэпаратах з новым метыленавым сінім яны выглядаюць як круглыя цельцы, часта адзінкавыя і размешчаныя каля мембраны, афарбаваныя ў больш светлы сіні колер, чым сеткавата-ніткападобны матэрыял. Яны дрэнна захоўваюцца пасля фіксацыі і дадатковага афарбоўвання, таму даследуйце нефіксаваны мазок. У нядаўнім пратаколе з выкарыстаннем 20 мікралітраў крыві з EDTA, 20 мікралітраў 1-працэнтнага новага метыленавага сіняга і 15 хвілін інкубацыі колькасць клетак з цельцамі Гейнца вызначалі сярод 250 эрытрацытаў, як апісана ў даследаванні PMC з гэтай працэдурай.

Два адрозненні дапамагаюць пазбегнуць памылковай інтэрпрэтацыі. Па-першае, метылавы фіялетавы і крышталічны фіялетавы афарбоўваюць цельцы Гейнца больш інтэнсіўна, чым новы метыленавы сіні, як адзначана ў тэматычным раздзеле ScienceDirect пра цельцы Гейнца. Новы метыленавы сіні — зручны выбар, калі рэтыкулацыты і цельцы Гейнца ацэньваюцца разам, але не самы моцны спецыялізаваны фарбавальнік для цельцаў Гейнца. Па-другое, пры носьбіцтве альфа-таласеміі ўключэнні HbH пасля суправітальнага афарбоўвання ўтвараюць шматлікія дробныя кропкі па ўсёй клетцы, тады як класічных цельцаў Гейнца менш, яны буйнейшыя і часта звязаныя з мембранай. Трэці імітатар — адклады фарбавальніка: яны ляжаць па-за факальнай плоскасцю клетак і адрозніваюцца паміж палямі зроку.

Брыльянтавы крэзілавы сіні ў параўнанні з новым метыленавым сінім

Абодва фарбавальнікі выкарыстоўваюцца для суправітальнага афарбоўвання рэтыкулацытаў, але стандартызацыя аддае перавагу аднаму з іх. Метад для рэтыкулацытаў CLSI H44-A2, распрацаваны сумесна з Міжнароднай радай па стандартызацыі ў гематалогіі і прадстаўлены на старонцы стандарту CLSI H44, вызначае афарбоўванне крыві з EDTA новым метыленавым сінім як ручны параўнальны метад. Класічныя дапаможнікі па гематалогіі аднолькава апісваюць выгляд афарбоўкі: новы метыленавы сіні дае больш інтэнсіўнае і раўнамернае афарбоўванне нітак, тады як брыльянтавы крэзілавы сіні паказвае большую варыябельнасць паміж партыямі і ўзорамі.

Гэты статус патрабуе ўдакладнення. Рэкамендацыі ICSH па ацэнцы аналізатараў прымаюць ручную мікраскапію з новым метыленавым сінім як рэферэнтны падыход для параўнання, але называюць яе суб'ектыўнай і адносна недакладнай, аддаючы перавагу рэферэнтным працэдурам праточнай цытаметрыі, калі яны даступныя. Параўнанне 100 узораў у 2022 годзе выявіла меншае сістэматычнае адхіленне ад вынікаў выкарыстанага аналізатара пры брыльянтавым крэзілавым сінім, чым пры новым метыленавым сінім; пра гэта паведамляецца ў параўнанні метадаў афарбоўвання на PMC. Абгрунтаваная выснова для студэнтаў: выкарыстоўвайце новы метыленавы сіні як стандартызаваны сродак ручнога параўнання, правярайце любы мясцовы метад з брыльянтавым крэзілавым сінім адносна яго або аўтаматызаванага метаду і ў любым выпадку чакайце большага роскіду вынікаў ручной мікраскапіі. Ранейшая літаратура па стандартызацыі таксама прапаноўвала ачышчаны Azure B як хімічна больш чыстую альтэрнатыву праз адрозненні паміж партыямі камерцыйных фарбавальнікаў, што апісана ў даследаванні Маршала пра Azure B; гэта тлумачыць, чаму ступень чысціні рэагента па-ранейшаму згадваецца пры абмеркаванні метадаў.

Як пазбегнуць тыповых памылак

Чатыры памылкі тлумачаць большасць няўдалых прэпаратаў. Заказ звычайнага метыленавага сіняга замест новага метыленавага сіняга N прыводзіць да слабага афарбоўвання з прычыны хіміі, а не тэхнікі. Фіксацыя або дадатковае афарбоўванне перад ацэнкай прыбірае суправітальны сігнал. Падлік асадку фарбавальніка як гранул завышае вынік; гэтага дапамагаюць пазбегнуць правіла дзвюх гранул і фільтраваны фарбавальнік. Падлік занадта малой колькасці клетак пры нізкай долі рэтыкулацытаў дае лік, які выглядае дакладным, але мае шырокія даверныя межы. Кожная памылка мае адну і тую ж прыкмету: мікраскапіст вінаваціць мікраскоп у тым, што было вызначана яшчэ на этапе працы з рэагентам.