Вымярэнне ўплыву метыленавага сіняга на мітахондрыі: кісларод, ATP і мембранны патэнцыял

Дапусцім, лабараторыя дадае метыленавы сіні да мітахондрый з парушаным дыханнем і назірае рост спажывання кіслароду. Натуральна было б напісаць, што фарбавальнік аднавіў функцыю мітахондрый. Але гэтае сцвярджэнне можа быць памылковым. Паток кіслароду, сінтэз ATP і мембранны патэнцыял — тры розныя паняцці. Іх аб'ядноўвае адна арганела гэтак жа, як рэзервовае капіраванне, сінхранізацыю і сумесны доступ аб'ядноўвае адна воблачная папка: яны звязаныя, але падпарадкоўваюцца розным правілам. Калі зблытаць адно з другім, інтэрпрэтацыя будзе хібнай, нават калі кожнае вымярэнне тэхнічна правільнае.

Метыленавы сіні павышае верагоднасць такой блытаніны, бо сам удзельнічае ў сістэме, якую вымяраюць. Ён цыклічна ўдзельнічае ў акісляльна-аднаўленчых рэакцыях, прымаючы электроны на ранейшых этапах ланцуга і аддаючы іх на пазнейшых; з'яўляецца ліпафільным катыёнам, які назапашваецца ў энергічна актыўных мітахондрыях; і мае інтэнсіўны сіні колер, паглынаючы і выпраменьваючы святло ў тых жа дыяпазонах, што і распаўсюджаныя зонды. Адзін паказчык не можа ахапіць усё гэта. Надзейны падыход, прадэманстраваны ў серыі будапешцкіх даследаванняў мітахондрый, — вымяраць паток кіслароду, хуткасць сінтэзу ATP, мембранны патэнцыял і выдзяленне пераксіду вадароду, на кожным этапе выкарыстоўваючы кантрольныя эксперыменты з улікам асаблівасцей фарбавальніка.

Рэспіраметрыя вымярае паток кіслароду, а не выхад энергіі

Рэспіраметрыя высокага разрознення, выкананая з дапамогай Oroboros Oxygraph або аналізатара пазаклеткавых патокаў Seahorse, паказвае адно: як хутка аднаўляецца кісларод. Яна не паказвае, колькі пратонаў было перапампавана на адзін электрон, якая доля градыенту захавалася і ці выкарыстала яго ATP-сінтаза.

Тэрміналогія мае значэнне. У ізаляваных мітахондрыях субстрат без ADP забяспечвае дыханне, звязанае з уцечкай пратонаў; субстрат з насычальнай канцэнтрацыяй ADP паказвае здольнасць да акісляльнага фасфарылявання; а тытраванне раз'ядноўвальнікам паказвае максімальную здольнасць да пераносу электронаў. У інтактных клетках адпаведныя паказчыкі Seahorse — гэта базальнае дыханне, адчувальнае да алігамiцыну дыханне, звязанае з сінтэзам ATP, уцечка пратонаў, максімальнае дыханне, вызначанае з дапамогай FCCP, і немітахандрыяльнае спажыванне кіслароду, устойлівае да ротэнону і антыміцыну. Назваць вынікі Seahorse станамі State 3 і State 4 — значыць прыпісаць ім дакладнасць, якой гэты тып прэпарату не забяспечвае, што выразна паказвае схема Agilent Mito Stress Test.

Метыленавы сіні парушае інтуітыўную сувязь паміж большым спажываннем кіслароду і большым выхадам энергіі. Паводле даследавання ізаляваных мітахондрый мозгу, у ізаляваных мітахондрыях мозгу марской свінкі фарбавальнік у канцэнтрацыях ад 100 nM да 1 uM павялічваў спажыванне кіслароду ў стане спакою пры выкарыстанні глутамату з малатам, сукцынату і альфа-гліцэрафасфату ў якасці субстратаў. На альфа-гліцэрафасфаце рост складаў прыкладна 64 працэнты, аднак стымуляванае ADP дыханне ў здаровых мітахондрыях практычна не змянялася. Паколькі дыханне, звязанае з уцечкай пратонаў, узрастала, а стымуляваны ADP паток заставаўся нязменным, разлічаны каэфіцыент дыхальнага кантролю зніжаўся. Такое зніжэнне не азначае, што фарбавальнік пашкодзіў мітахондрыі. Яно азначае, што да нармальнага дыхання фарбавальнік дадаў акісляльна-аднаўленчы цыкл, які спажывае кісларод. Аналіз спажывання кіслароду з метыленавым сінім, які паведамляе толькі пра гэты рост, вымярае рэальную хімічную рэакцыю, але нічога не кажа пра захаванне энергіі.

Эксперыменты па аднаўленні функцыі паказваюць той жа разрыў у большым маштабе. Пры блакаванні комплексу I паток кіслароду павялічыўся прыкладна ў тры разы, а сінтэз ATP — толькі прыкладна ў 1.5 раза. Да электрода даходзіла больш кіслароду, але меншая яго доля забяспечвала сінтэз ATP. Любое сцвярджэнне пра паляпшэнне акісляльнага фасфарылявання патрабуе даных пра ATP, пажадана ў выглядзе суадносін ATP да кіслароду з выразна пазначаным спосабам вызначэння назоўніка.

Аналізы ATP вымяраюць хуткасць сінтэзу, якую нельга замяніць утрыманнем

Аналіз ATP адказвае на іншае пытанне: колькі ATP утвараецца за адзінку часу. Кінетычнае вымярэнне — люмінесцэнцыя люцыферазы светлячка, якую адсочваюць на працягу некалькіх хвілін, або спалучаны аналіз з гексакіназай і глюкоза-6-фасфатдэгідрагеназай з вымярэннем пры 340 nm — дае хуткасць. Аднаразовае вымярэнне агульнай колькасці ATP ў канчатковай кропцы дае ўтрыманне, якое адлюстроўвае розніцу паміж сінтэзам і спажываннем і само па сабе мала што кажа пра акісляльнае фасфарыляванне.

Будапешцкая група выкарыстала спалучаны ферментатыўны метад з прыгнечанай адэнілаткіназай і выявіла, што метыленавы сіні ў канцэнтрацыях ад 1 да 2 uM умерана, але статыстычна значна павялічваў выпрацоўку ATP ў мітахондрыях, апрацаваных ротэнонам і антыміцынам. Гэта сапраўднае, але частковае аднаўленне. Даследаванне таксічнасці TEGDMA дало падобны вынік у іншай мадэлі: 5 mM стаматалагічнага манамера TEGDMA рэзка зніжалі дыханне, звязанае з комплексам I, прыкладна з 286 да 28 адзінак патоку, а 2 uM фарбавальніка аднаўлялі яго прыкладна да 86.

Для афарбаванага акісляльна-аднаўленча актыўнага злучэння два кантрольныя эксперыменты абавязковыя. Па-першае, выкарыстоўвайце алігамiцын, каб вызначыць, якая доля вымеранага сінтэзу ATP залежыць ад ATP-сінтазы. Па-другое, правядзіце бесклетачны тэст аднаўлення дабаўленай вядомай колькасці ATP з поўным наборам рэагентаў і тымі самымі канцэнтрацыямі фарбавальніка, якія выкарыстоўваюцца ў эксперыменце: як мінімум 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM і 2 uM. Фарбавальнік можа паглынаць выпраменьванае святло, інгібіраваць рэпарцёрны фермент або змяняць акісляльна-аднаўленчую хімію рэагентаў, і агульныя рэкамендацыі па люцыферазных аналізах раяць праводзіць біяхімічныя контрскрынінгі менавіта для такога класа перашкод. Не лічыце, што пры 1 uM артэфактаў няма, толькі таму, што гашэнне звычайна мацнейшае пры больш высокіх канцэнтрацыях.

Зонды мембраннага патэнцыялу вымяраюць размеркаванне фарбавальніка, а не паток

Сафранін O, TMRM і TMRE, радамін 123 і JC-1 — усе яны з'яўляюцца катыёнамі, здольнымі праходзіць праз мембраны. Яны назапашваюцца ў адмоўна зараджаным матрыксе ў адпаведнасці з электрахімічнай раўнавагай, таму сумарная флуарэсцэнцыя ўскосна паказвае патэнцыял праз месцазнаходжанне зонда. Ніводзін з іх не вымярае ATP або паток электронаў.

Кожны зонд найбольш прыдатны для пэўнага тыпу прэпарату. Сафранін O падыходзіць для ізаляваных мітахондрый і пермеабілізаваных клетак, звычайна ў канцэнтрацыі каля 2 uM, з узбуджэннем каля 495 nm і выпраменьваннем каля 585 nm. Ён працуе ў рэжыме гашэння, калі паглынанне зонда мітахондрыямі змяняе сумарную флуарэсцэнцыю. TMRM і TMRE падыходзяць для інтактных клетак пры нізкай нанамалярнай загрузцы ў рэжыме без гашэння: дэпалярызацыя вызваляе фарбавальнік, і мітахандрыяльная флуарэсцэнцыя зніжаецца; пры высокай загрузцы кірунак змены сігналу можа інвертавацца праз самагашэнне. JC-1 дае зручныя суадносіны зялёнай і чырвонай флуарэсцэнцыі, але залежыць ад загрузкі і масы мітахондрый, таму для колькасных даследаванняў ён менш прыдатны, чым TMRM пры старанным кантролі ўмоў. Гэтыя кампрамісы абагульнены ў шырока выкарыстоўваным аглядзе зондаў мітахандрыяльнага мембраннага патэнцыялу.

Метыленавы сіні стварае аптычныя перашкоды менавіта ў рабочых канцэнтрацыях. Яго палосы паглынання ў дыяпазоне прыкладна ад 600 да 665 nm перакрываюцца з чырвоным выпраменьваннем зондаў, таму эфект унутранага фільтра, гашэнне і паглынанне ўзбуджальнага святла цалкам верагодныя. Акрамя таго, фарбавальнік — гэта другі ліпафільны катыён, уласнае размеркаванне якога змяняецца ў залежнасці ад патэнцыялу, што вымяраецца. Абарона ад гэтых перашкод — незалежныя вымярэнні і халастыя пробы: толькі зонд, толькі фарбавальнік, зонд з кожнай канцэнтрацыяй фарбавальніка, поўная дэпалярызацыя з FCCP як нулявы арыенцір і, у ідэале, другі зонд з іншымі аптычнымі ўласцівасцямі. Даследаванне абыходу комплексу III задало такі ўзор: пасля інгібіравання антыміцынам і міксатыязолам аднаўленне мембраннага патэнцыялу паўторна вымералі з выкарыстаннем і сафраніну O, і TMRM, атрымаўшы аднолькавае якаснае аднаўленне. Адзін аптычны рэпарцёр — падказка. Два незалежныя рэпарцёры — доказ.

Тры тыпы прэпаратаў, тры розныя пытанні

Ізаляваныя мітахондрыі, пермеабілізаваныя клеткі і інтактныя клеткі — не ўзаемазаменныя налады адчувальнасці аднаго аналізу. Гэта розныя мадэлі з рознымі прынцыпамі працы.

Ізаляваныя мітахондрыі захоўваюць электрон-транспартны ланцуг, унутраную мембрану і функцыянальны апарат матрыксу, але пазбаўленыя плазматычнай мембраны, цытазолю і сеткавай архітэктуры. Менавіта ў гэтым і сэнс ізаляцыі: субстраты, ADP, інгібітары і канцэнтрацыі фарбавальніка задаюцца дакладна, што дазваляе вызначыць канкрэтны шлях. Цана гэтага — страта натуральнага забеспячэння субстратамі, сігналізацыі і патрэбы ў энергіі.

Пермеабілізаваныя клеткі захоўваюць мітахондрыі ў значнай частцы іх клеткавага асяроддзя, але прапускаюць экзагенныя субстраты і ADP праз адкрытую плазматычную мембрану. Гэта адпаведны інструмент для вызначэння дэфекту субстратнага шляху ў клеткавым кантэксце. Празмерная пермеабілізацыя пашкоджвае вонкавую мембрану, а цытазольная рэгуляцыя страчваецца пры вымыванні.

Інтактныя клеткі захоўваюць усё: бар'ер плазматычнай мембраны, цытазольныя аднаўляльнікі, эндагенны транспарт субстратаў, мітахандрыяльную сетку і патрэбу ў ATP. Яны найбліжэйшыя да фізіялогіі і найдалейшыя ад дакладнага вызначэння механізму, бо паглынанне, аднаўленне і секвестрацыя фарбавальніка разам вызначаюць яго фактычнае ўздзеянне на мітахондрыі.

У даследаванні TEGDMA мэтанакіравана выкарыстоўвалі ўсе тры ўзроўні: ізаляваныя мітахондрыі мозгу — для вывучэння аднаўлення акіслення і патэнцыялу фарбавальнікам; пермеабілізаваныя ствалавыя клеткі зубной пульпы — пераважна для лакалізацыі парушэння ў акісленні субстратаў, звязаным з комплексам I; інтактныя ствалавыя клеткі — для вызначэння сукупнага фізіялагічнага ўплыву 2 uM фарбавальніка на прыгнечанае спажыванне кіслароду. Чытачам, якія параўноўваюць мітахандрыяльныя паказчыкі ў розных тыпах прэпаратаў, дадатковае тлумачэнне таго, як метыленавы сіні пераносіць электроны праз дыхальны ланцуг, дае звесткі пра адпаведныя шляхі, а дапаможнік па інтэрпрэтацыі даследаванняў дыхання з метыленавым сінім разглядае логіку выбару доз і інгібітараў.

Кантрольныя эксперыменты, якіх патрабуе акісляльна-аднаўленча актыўны фарбавальнік

Злучэнне, якое ўдзельнічае ў акісляльна-аднаўленчых цыклах, патрабуе больш доўгага спісу кантрольных эксперыментаў, чым звычайны інгібітар, бо хімічныя рэакцыі самога фарбавальніка могуць імітаваць біялагічныя працэсы.

Для рэспіраметрыі выкарыстоўвайце камеру толькі з буферам для ацэнкі дрэйфу, камеру з буферам і фарбавальнікам без біялагічнага матэрыялу, фарбавальнік з любым пазаклеткавым аднаўляльнікам, прысутным у аналізе, а напрыканцы — ротэнон з антыміцынам для вызначэння немітахандрыяльнага спажывання кіслароду ў інтактных клетках. Улічвайце, што адноўлены фарбавальнік паўторна акісляецца, перадаючы электроны кіслароду з утварэннем пераксіду вадароду. Таму халастая проба толькі з фарбавальнікам без донара электронаў недаацэньвае бесклетачнае спажыванне кіслароду, якое ўзнікае пры наяўнасці NADH або NADPH.

Для пераксіду вадароду аддавайце перавагу адкалібраванаму Amplex UltraRed з пераксідазай хрэну, а не неселектыўным фарбавальнікам DCFDA; правярайце вынік з дапамогай каталазы і даследуйце залежнасць ад асвятлення, бо фарбавальнік з'яўляецца фотасенсібілізатарам. Даследаванне мітахондрый мозгу выявіла, што ўжо пры 100 nM фарбавальніка пераксідная нагрузка ўзрастала больш чым у чатыры разы, а выдаленне пераксіду запавольвалася. Пры гэтым пераксід утвараўся непасрэдна з удзелам адноўленага фарбавальніка, без прамежкавага ўтварэння супераксіду. Падрабязнасці выбару зонда і кантролю асвятлення разглядаюцца ў дадатковым матэрыяле пра вымярэнне актыўных формаў кіслароду ў эксперыментах з фарбавальнікам, а больш шырокае пытанне пра тое, калі пераксід дзейнічае як сігнал, а калі — як нагрузка, асвятляецца разам з клеткавым акісляльна-аднаўленчым балансам і сцвярджэннямі пра антыаксіданты.

Для сцвярджэнняў пра шлях пераносу правярайце абодва ўчасткі дзеяння інгібітараў комплексу III: антыміцын A на ўчастку Qi і міксатыязол на ўчастку Qo, а таксама канцавы этап на комплексе IV з выкарыстаннем цыяніду. Больш ранняе даследаванне мозгу мышэй паведамляла пра аднаўленне фарбавальнікам дыхання, заблакаванага ротэнонам, але не антыміцынам. Пазнейшае даследаванне на трох відах выявіла частковае аднаўленне з абодвума інгібітарамі і сведчанні прамога аднаўлення цытахрому c. Разглядайце абыход як механізм, сумяшчальны з новымі данымі, а не як канчаткова ўстаноўлены факт, бо канцэнтрацыя фарбавальніка, участак дзеяння інгібітара, стан субстрату і размеркаванне фарбавальніка змяняюць назіраны маршрут.

Матрыца выбару аналізаў

Выкарыстоўвайце гэтую табліцу, каб выбіраць вымярэнне паводле пытання, а не наадварот.

Мінімальна пераканаўчае сцвярджэнне патрабуе выкарыстання адных і тых жа канцэнтрацый фарбавальніка — 100 nM, 300 nM, 1 uM і 2 uM — для вымярэння патоку кіслароду ва ўмовах уцечкі пратонаў, з ADP, алігамiцынам і раз'ядноўвальнікам; хуткасці сінтэзу ATP; мембраннага патэнцыялу, пажадана з двума зондамі; і адкалібраванага выдзялення пераксіду з каталазай і бесклетачнымі кантрольнымі пробамі. Паведамляйце ўвесь звязаны набор: паток кіслароду, хуткасць сінтэзу ATP, суадносіны ATP да кіслароду, патэнцыял і пераксід. Любая з гэтых лічбаў паасобку — гэта вымярэнне, якому яшчэ трэба знайсці сэнс.