Простае афарбоўванне метыленавым сінім і афарбоўванне паводле Грама: што можа пацвердзіць кожны метад

Студэнт рыхтуе мазок з культуры з пазнакай E. coli, залівае яго метыленавым сінім на адну хвіліну, прамывае і разглядае праз алейны імерсійны аб’ектыў. Поле зроку запоўнена сінімі палачкамі. У лабараторнай справаздачы напісана: «Грамадмоўныя палачкі, ідэнтыфікаваныя як E. coli». Назіранне правільнае. Але гэты прэпарат не дае падстаў для такой высновы.

Памылка тут канцэптуальная, а не тэхнічная. Студэнт паставіўся да простага афарбоўвання так, нібыта гэта дыферэнцыяльны тэст. Простае афарбоўванне і афарбоўванне паводле Грама адказваюць на розныя пытанні, бо грунтуюцца на розных прынцыпах. Першае пытаецца: якая форма прысутнічае. Другое пытаецца: як паводзіць сябе клетачная сценка пры ўздзеянні. Калі пераблытаць гэтыя метады, правільна афарбаваны прэпарат прывядзе да неабгрунтаванай справаздачы.

У гэтым параўнанні два метады разглядаюцца асобна: паказана, якія сцвярджэнні дазваляе зрабіць кожны вынік, і дадзены адказы на два пытанні, якія студэнты задаюць найчасцей: ці можна выкарыстоўваць метыленавы сіні ў афарбоўванні паводле Грама і што насамрэч паказвае афарбоўванне E. coli метыленавым сінім.

Кароткі адказ

Пры простым афарбоўванні метыленавы сіні надае ўсім клеткам, якія паддаюцца афарбоўванню, аднолькавы сіні колер. Таму ён выяўляе марфалогію (палачкі, шары, спіралі) і размяшчэнне (паасобку, парамі, ланцужкамі), але нічога не кажа пра прыналежнасць да групы паводле Грама. Афарбоўванне паводле Грама дадае ёд, этап абясколервання і дафарбавальнік, таму падзяляе бактэрыі на грамстаноўчыя (фіялетавыя) і грамадмоўныя (ружовыя або чырвоныя) паводле таго, як іх клетачныя абалонкі ўтрымліваюць фарбавальнік. Сінія палачкі пасля метыленавага сіняга азначаюць: «прысутнічаюць палачкападобныя клеткі». Ружовыя палачкі пасля поўнай паслядоўнасці афарбоўвання паводле Грама азначаюць: «прысутнічаюць грамадмоўныя палачкі». Другое сцвярджэнне больш абгрунтаванае, бо працэдура ўключала дадатковы тэст.

Пра шырэйшую групу метадаў афарбоўвання бактэрый адным фарбавальнікам, да якой адносіцца гэты артыкул, глядзіце атлас афарбоўвання для мікраскапіі.

Простае афарбоўванне: адзін фарбавальнік, адно пытанне

Метыленавы сіні — асноўны (катыённы) фарбавальнік. Яго афарбаваны іён мае станоўчы зарад і звязваецца з адмоўна зараджанымі структурамі клеткі, у тым ліку з нуклеінавымі кіслотамі і кіслымі групамі на паверхні, таму клеткі выглядаюць сінімі на светлым фоне. OpenStax апісвае гэты прынцып пазітыўнага афарбоўвання ў раздзеле пра афарбоўванне. Сам катыён фарбавальніка — невялікі плоскі фенатыязінавы іён, падрабязна апісаны ў даведніку па хіміі метыленавага сіняга; хларыдны супрацьіён не ўдзельнічае ў афарбоўванні.

Стандартны навучальны пратакол наўмысна просты: зрабіць тонкі мазок, высушыць на паветры, зафіксаваць награваннем, заліць прыблізна 1% водным растворам метыленавага сіняга прыкладна на адну хвіліну, асцярожна прамыць вадой, прамакнуць да сухога стану і разгледзець з алейнай імерсіяй. Навучальны пратакол LibreTexts прыводзіць менавіта такі варыянт: 1% раствор на адну хвіліну, адзначаючы, што некаторыя лабараторыі павялічваюць час. Ні пратравы, ні абясколервальніка, ні другога фарбавальніка. Менавіта ў гэтай адсутнасці і сутнасць. Калі выкарыстоўваецца толькі адзін фарбавальнік без выбарачнага выдалення, усе клеткі, якія звязваюць фарбавальнік, набываюць аднолькавы колер.

Для E. coli чакаецца поле з сінімі палачкамі (бацыламі), размешчанымі паасобку, парамі або невялікімі групамі. Сіні колер дае фарбавальнік. Палачкападобная форма — уласцівасць арганізма. Але гэта спалучэнне не ідэнтыфікуе арганізм, бо многія віды маюць форму палачак, а многія палачкі пры простым афарбоўванні становяцца сінімі. ATCC выразна адзначае гэтае абмежаванне толькі марфалогіяй у сваім кіраўніцтве па культываванні мікраарганізмаў. Правільны запіс у справаздачы: «назіраюцца сінія бацылы». Любое сцвярджэнне па-за межамі формы і размяшчэння патрабуе дадатковых доказаў.

Афарбоўванне паводле Грама: чатыры рэагенты, адзін тэст паводзін

Афарбоўванне паводле Грама — дыферэнцыяльнае афарбоўванне. Усе клеткі праходзяць аднолькавую паслядоўнасць, пасля чаго вызначаюць, якія клеткі ўтрымалі першы фарбавальнік, а якія яго страцілі. Пратаколы афарбоўвання паводле Грама Амерыканскага таварыства мікрабіялогіі вызначаюць стандартную паслядоўнасць з чатырох этапаў: крышталічны фіялетавы (асноўны фарбавальнік), ёд Грама (пратрава), спірт або ацэтон-спіртавы раствор (абясколервальнік), затым сафранін (дафарбавальнік).

Стандартная навучальная мадэль тлумачыць гэты падзел будовай клетачных абалонак. Грамстаноўчыя клеткі маюць тоўстую пептыдагліканавую сценку, якая абязводжваецца і ўтрымлівае комплекс крышталічнага фіялетавага з ёдам падчас прамывання спіртам. Грамадмоўныя клеткі маюць тонкі пласт пептыдаглікану і багатую ліпідамі вонкавую мембрану, якую парушае абясколервальнік. Таму комплекс вымываецца, а клеткі затым паглынаюць сафранін. Агляд афарбоўвання паводле Грама ў NCBI Bookshelf прыводзіць гэтае тлумачэнне праз клетачную сценку. Спецыялісты дадаюць, што поўная фізіка-хімічная карціна складанейшая за адну толькі таўшчыню сценкі, але для інтэрпрэтацыі ў лабараторыі правіла паводзін застаецца сапраўдным: фіялетавы колер азначае ўтрыманне фарбавальніка, ружовы — яго страту з наступным дафарбоўваннем.

Ілюстрацыйныя панэлі. Стылізаваныя малюнкі для параўнання метадаў, а не мікрафатаграфіі з камеры. Колеры спрошчаны, каб патлумачыць логіку: адзін колер пры простым афарбоўванні, два колеры пасля абясколервання паводле Грама.

Ці можна выкарыстоўваць метыленавы сіні ў афарбоўванні паводле Грама

Гэтае пытанне можна зразумець двума спосабамі, і яны патрабуюць розных адказаў.

Першае разуменне: ці можа аднаразовае заліванне метыленавым сінім замяніць усю паслядоўнасць афарбоўвання паводле Грама. Не. Без ёду, абясколервальніка і дафарбавальніка няма дыферэнцыяльнага этапу, таму прыналежнасць да групы паводле Грама не правяраецца. Сіняе поле пасля аднаго толькі метыленавага сіняга — вынік простага афарбоўвання, нават калі флакон стаіць побач з рэагентамі для афарбоўвання паводле Грама. Не запісвайце яго як вынік афарбоўвання паводле Грама.

Другое разуменне: ці можа метыленавы сіні замяніць сафранін як дафарбавальнік на этапе 4. Функцыянальна ён можа афарбаваць абясколераныя клеткі, і навучальнае практыкаванне прагназуе пасля такой замены фіялетавыя грамстаноўчыя клеткі і сінія грамадмоўныя клеткі. Гэтая логіка абгрунтаваная, бо правільна абясколераныя грамадмоўныя клеткі амаль бясколерныя і паглынуць іншы катыённы фарбавальнік. Але гэта не стандартны пратакол. Пратаколы ASM вызначаюць сафранін, а ў некаторых варыянтах — прызнаныя альтэрнатывы, такія як асноўны фуксін, але не метыленавы сіні. Ёсць і практычны недахоп: сіні колер на фоне фіялетавага цяжэй адрозніць, чым ружовы на фоне фіялетавага, асабліва пачаткоўцам і асабліва пры аслабленым святле лямпаў мікраскопа. Для навучальных работ і любых значных вынікаў выкарыстоўвайце дафарбавальнік, указаны ў вашым пратаколе, звычайна сафранін, а дафарбоўванне метыленавым сінім разглядайце як дэманстрацыйны варыянт, а не раўназначны стандарт.

Звязанае пытанне пра тое, як метыленавы сіні суадносіцца з іншымі варыянтамі афарбоўвання адным фарбавальнікам, разглядаецца ў параўнанні простых метадаў афарбоўвання бактэрый.

Што пацвярджае афарбоўванне E. coli метыленавым сінім, а чаго не пацвярджае

E. coli — грамадмоўная палачка, але гэты сказ аб’ядноўвае факты, атрыманыя рознымі метадамі: марфалогію — з мікраскапіі, рэакцыю паводле Грама — з афарбоўвання паводле Грама, ідэнтычнасць — з культывавання і біяхімічных або малекулярных даследаванняў. Мазок, афарбаваны метыленавым сінім, дадае толькі першую частку. Ён пацвярджае наяўнасць палачкападобных клетак у афарбаваным узоры і паказвае іх размяшчэнне. Ён не вызначае рэакцыю паводле Грама, бо ўздзеянне абясколервальніка не правяралася. Ён не ідэнтыфікуе від, бо палачкі многіх відаў выглядаюць падобна пры такой раздзяляльнай здольнасці.

Менавіта тут у справаздачах узнікае прадказальная памылка. Аўтар пераносіць папярэднія веды («гэтая культура павінна быць E. coli, а E. coli — грамадмоўная») у запіс назірання, і здаецца, нібыта прэпарат пацвярджае тое, што насамрэч было толькі дапушчэннем. Больш дакладная справаздача раздзяляе гэтыя ўзроўні: «Простае афарбоўванне метыленавым сінім: назіраюцца сінія бацылы; толькі марфалогія, прыналежнасць да групы паводле Грама не правяралася». Затым, калі афарбоўванне паводле Грама было правільна выканана з кантрольнымі ўзорамі: «Афарбоўванне паводле Грама: ружовыя палачкі, што адпавядае грамадмоўнай рэакцыі». Відавая прыналежнасць вызначаецца пазней, у працэсе ідэнтыфікацыі, а не толькі паводле колеру.

Практычнае кіраўніцтва па інтэрпрэтацыі

Карыстайцеся гэтым правілам пры лабараторнай працы. Калі ўсе клеткі аднаго колеру, а пратакол прадугледжваў адзін фарбавальнік без абясколервальніка, вы выканалі простае афарбоўванне. Укажыце форму, прыблізны памер і размяшчэнне. На гэтым спыніцеся. Калі пратакол уключаў крышталічны фіялетавы, ёд, абясколервальнік і дафарбавальнік з вядомымі станоўчымі і адмоўнымі кантрольнымі ўзорамі, вы выканалі афарбоўванне паводле Грама. Укажыце колер разам з марфалогіяй: фіялетавыя кокі ў ланцужках, ружовыя палачкі і гэтак далей.

Большасць блытаніны выклікаюць тры памылкі. Першая — празмерная інтэрпрэтацыя сініх палачак як пацвярджэння E. coli. Другая — запіс прэпарата, афарбаванага метыленавым сінім, пад загалоўкам «Афарбоўванне паводле Грама» ў журнале, што пазнейшыя чытачы зразумеюць няправільна. Трэцяя — адвольная замена дафарбавальнікаў з наступным параўнаннем колераў паміж лабараторыямі так, нібыта палітры аднолькавыя. Усе гэтыя памылкі выпраўляюцца аднолькава: называйце метад, які сапраўды быў выкананы, і сцвярджайце толькі тое, што гэты метад правярае.

Простае афарбоўванне мае сваю каштоўнасць менавіта таму, што дазваляе сцвярджаць няшмат. Яно хуткае, не надта адчувальнае да невялікіх адхіленняў у выкананні і дастатковае, калі пытанне датычыцца марфалогіі: ці ёсць нешта ва ўзоры і якую форму яно мае. Калі пытанне датычыцца класіфікацыі, выканайце дыферэнцыяльны тэст. Сіні прэпарат паказвае, як выглядаюць клеткі. Фіялетавы або ружовы прэпарат паказвае, як паводзяць сябе іх сценкі. Ніводны з гэтых прэпаратаў сам па сабе не вызначае від.