Метыленавы сіні, Nrf2 і мітахандрыяльны біягенез: тлумачэнне

У тэкстах пра метыленавы сіні часта сустракаецца адзін сказ: ён актывуе Nrf2 і стварае новыя мітахондрыі. Гэты сказ чытаецца як адно сцвярджэнне, але змяшчае два розныя паняцці, вывучаныя ў розных сістэмах і падмацаваныя рознымі тыпамі доказаў. Першае — гэта сігнальны шлях, датчык, які ўключае ахоўныя гены. Другое — праграма будаўніцтва, падчас якой клетка стварае больш мітахандрыяльнага апарату. Сігнал можа запусціць будаўніцтва, але паказаць, што сігнал спрацаваў, — не тое самае, што паказаць, што будынак узведзены; а паказаць, што будаўнічага матэрыялу стала больш, — не тое самае, што паказаць паляпшэнне энергазабеспячэння. У гэтым артыкуле гэтыя тры рэчы разглядаюцца асобна.

Паняцце Nrf2: датчык, а не шчыт

Nrf2 (фактар 2, звязаны з ядзерным эрытроідным фактарам 2) — гэта транскрыпцыйны фактар, бялок, задача якога — уключаць гены. У стане спакою яго ўтрымлівае ў цытаплазме бялок-датчык Keap1, які перадае яго клетачнаму апарату ўтылізацыі для бесперапыннага разбурэння. Калі акісляльнікі або электрафілы мадыфікуюць рэакцыйназдольныя рэшткі цыстэіну ў Keap1, утылізацыя спыняецца. Новаўтвораны Nrf2 назапашваецца, перамяшчаецца ў ядро, утварае пары з малымі бялкамі Maf і звязваецца з паслядоўнасцямі ДНК, якія называюцца элементамі антыаксідантнага адказу. Гэтае звязванне ўключае цэлы набор ахоўных генаў.

Кананічныя паказчыкі гэтага шляху спецыфічныя. NQO1 (NAD(P)H-хінондэгідрагеназа 1) і TrxR1 (тыярэдаксінрэдуктаза 1) належаць да найбольш надзейных генаў-мішэняў Nrf2. HO-1 (гемаксігеназа-1) моцна індукуецца, але рэагуе і на іншыя рэгулятары. Такія ферменты, як SOD і каталаза, уваходзяць у антыаксідантны апарат, але іх узроўні кантралююцца многімі транскрыпцыйнымі фактарамі, таму павышэнне SOD само па сабе не даказвае, што прычынай быў Nrf2. Найбліжэйшыя да самой сігнальнай падзеі доказы — гэта назапашванне Nrf2 у ядры, актывацыя рэпарцёра ARE або індукцыя кананічных мішэняў, якая знікае пры выдаленні Nrf2. Усё астатняе — зніжэнне ўзроўню акісляльнікаў, лепшая выжывальнасць ва ўмовах стрэсу, павышэнне ўзроўню глутатыёну — гэта наступныя эфекты, якія могуць узнікаць праз мноства шляхоў.

Самы ранні вынік з метыленавым сінім у гэтай гісторыі знаходзіцца блізка да гэтага канца шкалы доказаў. У фібрабластах, якія падвяргаліся ўздзеянню нанамалярных канцэнтрацый метыленавага сіняга, назіралі затрымку клетачнага старэння разам з павелічэннем утрымання комплексу IV, павышэннем спажывання кіслароду і індукцыяй ферментаў фазы 2 TrxR1 і NQO1, як паведамлялася ў даследаванні, якое ўпершыню звязала метыленавы сіні з паляпшэннем працы мітахондрый і затрымкай клетачнага старэння. TrxR1 і NQO1 — менавіта тыя кананічныя мішэні Nrf2, якія ўважлівы чытач хоча ўбачыць. Чаго даследаванне не паказала, дык гэта самой сігнальнай падзеі: не было ні вымярэння Nrf2 у ядры, ні рэпарцёра ARE, ні кантролю з накаўтам Nrf2. Таму карэктнае прачытанне такое: метыленавы сіні індукуе вядомыя гены-мішэні Nrf2 у гэтай сістэме, што ўзгадняецца з актывацыяй Nrf2, але не дазваляе вылучыць Nrf2 як прычыну. Індукцыя гена-мішэні адбываецца на адзін крок пазней за спрацоўванне пераключальніка.

Паняцце біягенезу: праграма з трыма кантрольнымі пунктамі

Мітахандрыяльны біягенез — гэта праграма, праз якую клетка нарошчвае мітахандрыяльны патэнцыял. Яго класічная іерархія праходзіць праз тры кантрольныя пункты. Па-першае, каактыватар PGC-1alpha ўключае праграму. Па-другое, ядзерныя транскрыпцыйныя фактары (адзін з іх, што можа збіваць з панталыку, называецца NRF1, ядзерны рэспіраторны фактар 1, і гэта іншы бялок, чым Nrf2) стымулююць экспрэсію мітахандрыяльных генаў, у тым ліку TFAM, які падтрымлівае і рэплікуе мітахандрыяльную ДНК. Па-трэцяе, у выніку клетка мае больш мітахандрыяльных геномаў і больш дыхальнага апарату, што можна вымераць па колькасці копій mtDNA, актыўнасці цытратсінтазы або колькасці і актыўнасці дыхальных комплексаў.

Кожны кантрольны пункт абгрунтоўвае слабейшае або мацнейшае сцвярджэнне ў параўнанні з папярэднім. Павышэнне ўзроўню інфармацыйнай РНК PGC-1alpha або TFAM паказвае, што быў пададзены запыт на праграму, але не што яна завяршылася. Больш mtDNA або бялку комплексу IV паказвае, што матэрыялу стала больш, але перабудова мітахондрый можа выглядаць гэтак жа. Лепшае дыханне, павышанае спажыванне кіслароду або актыўнасць комплексаў паказваюць, што функцыя змянілася, але функцыя можа палепшыцца наогул без утварэння новых мітахондрый. Моцнае сцвярджэнне пра біягенез спалучае ўсе тры складнікі: рэгулятар, утрыманне і функцыю.

Наступнае даследаванне фібрабластаў прайшло большую частку гэтага ланцуга. У клетках чалавека IMR90, апрацаваных метыленавым сінім у канцэнтрацыі 100 нанамоляў на літр, суадносіны NAD да NADH часова павысіліся на працягу 15 хвілін і вярнуліся да зыходнага ўзроўню на працягу сутак. За гэтым кароткачасовым энергетычным сігналам ішло кароткачасовае фасфарыляванне энергетычнага датчыка AMPK, а затым індукцыя PGC-1alpha і SURF1 — бялку, неабходнага для зборкі працаздольнага комплексу IV. Актыўнасць комплексу IV прыкладна падвоілася, узровень клетачных акісляльнікаў знізіўся прыкладна на 28 працэнтаў, а тэламеры скарачаліся павольней. Поўная паслядоўнасць выкладзена ў артыкуле, які звязвае акісляльна-аднаўленчую актыўнасць метыленавага сіняга з AMPK і мітахандрыяльным біягенезам.

Дзве дэталі гэтага артыкула заслугоўваюць увагі, бо такія падрабязнасці звычайна апускаюць. Па-першае, характар актывацыі меў большае значэнне, чым сам яе факт: метыленавы сіні ўключаў AMPK кароткачасова, тады як прэпарат параўнання AICAR — працягла, і кароткачасовы актыватар затрымліваў клетачнае старэнне прыкладна ў восем разоў больш эфектыўна. Таму сцвярджэнне «метыленавы сіні актывуе AMPK» няпоўнае; істотна тое, што ён актывуе AMPK кароткачасова, а параўнанне паказвае, што працяглая актывацыя не дае таго самага выніку. Па-другое, метыленавы сіні не змяняў клетачны цыкл, што выключае самае банальнае альтэрнатыўнае тлумачэнне: клеткі проста дзяліліся павольней і таму выглядалі маладзейшымі.

Даследаванні на мышах: паводзіны, геномы і наўмысна парадаксальны пускавы механізм

Група, якая вывучала мышэй сярэдняга ўзросту, пашырыла працу на клетачных культурах да даследаванняў на жывёлах. Пасля 60 дзён прыёму метыленавага сіняга праз рот мышы, якія яго атрымлівалі, лепш захоўвалі фізічную вынослівасць і даследчыя паводзіны і дэманстравалі менш трывожнападобных паводзін, чым мышы старэйшага ўзросту, якія яго не атрымлівалі. У тканцы мозгу экспрэсія генаў, прыгнечаная старэннем, — NRF1, TFAM, SOD2 і субадзінкі комплексу IV COX1 — аднавілася ў напрамку ўзроўняў дарослых жывёл, а колькасць копій mtDNA павялічылася. Гэтыя вынікі — паводзіны, рэгулятары і колькасць геномаў — апісаны ў даследаванні метыленавага сіняга і мітахандрыяльнага біягенезу ў мозгу мышэй сярэдняга ўзросту.

Прапанаваны пускавы механізм асабліва цікавы, бо ён супярэчыць простаму ўяўленню, што метыленавы сіні — антыаксідант. У мышэй, якія яго атрымлівалі, назіралася павышанае ўтварэнне актыўных формаў кіслароду ў мітахондрыях мозгу, у прыватнасці пераксіду вадароду. Гіпотэза аўтараў: менавіта слабы пераксідны сігнал актывуе шлях Nrf2, які затым запускае праграму біягенезу. У гэтай мадэлі метыленавы сіні выступае прааксідантам на этапе запуску і антыаксідантам на этапе выніку. Такую заканамернасць фармаколагі называюць гармезісам: невялікі стрэс выклікае ахоўны адказ, большы за сам стрэс. Ці сапраўды гэтае павышэнне пераксіду выклікае актывацыю Nrf2, непасрэдна не правяралі; гэта прапанаваная сувязь, а не вымеранае звяно.

Паралельнае даследаванне той самай групы праверыла гэтую гіпотэзу на трываласць з боку бяспекі. У ізаляваных мітахондрыях мозгу метыленавы сіні павышаў выпрацоўку пераксіду вадароду ўжо пры канцэнтрацыі 50 нанамоляў на літр, аднак тэрапеўтычныя канцэнтрацыі не выклікалі выяўленага пашкоджання мітахандрыяльнай ДНК. Толькі пры 100 мікрамолях на літр, што значна вышэй за тэрапеўтычныя ўзроўні, у асобных фрагментах mtDNA выяўлялі пашкоджанні, а спалучэнне фарбавальніка ў канцэнтрацыі 20 мікрамоляў на літр з чырвоным святлом утварала сінглетны кісларод, які пашкоджваў mtDNA па ўсёй малекуле. Гэта вядомыя фотасенсібілізавальныя ўласцівасці фарбавальніка, а не яго фармакалагічнае дзеянне ў цемры. Папярэдняя апрацоўка нават абараняла мітахондрыі вентральнай часткі сярэдняга мозгу ад пашкоджанняў mtDNA, выкліканых ратэнонам. Залежнасць адказу ад дозы і кантрольныя праверкі генатаксічнасці падрабязна апісаны ў даследаванні негенатаксічнага ўтварэння пераксіду пад дзеяннем метыленавага сіняга.

Вымеранае і прапанаванае: як чытаць схему

Схема шляху ніжэй была створана для гэтага артыкула, каб выразна зафіксаваць адрозненне, якое праводзіцца ў тэксце. Блокі з суцэльнымі межамі — гэта этапы з непасрэднай эксперыментальнай падтрымкай у літаратуры пра метыленавы сіні: акісляльна-аднаўленчы цыкл, які змяняе NAD/NADH, кароткачасовае фасфарыляванне AMPK, індукцыя PGC-1alpha і SURF1, павышэнне актыўнасці комплексу IV, індукцыя NQO1 і TrxR1, аднаўленне экспрэсіі генаў біягенезу і колькасці копій mtDNA ў мозгу мышэй, а таксама павышэнне ўзроўню пераксіду без пашкоджання mtDNA пры тэрапеўтычных дозах. Блокі з пункцірнымі межамі — гэта прапанаваныя сувязі: успрыманне пераксіднага сігналу бялком Keap1, назапашванне Nrf2 у ядры, якое запускае ахоўныя гены, і прычынная стрэлка ад актывацыі Nrf2 да праграмы біягенезу. Гэтыя пункцірныя этапы праўдападобныя, узгадняюцца з данымі і адпавядаюць класічным біялагічным уяўленням, але ў гэтых працах іх не вымяралі з тымі кантрольнымі праверкамі (Nrf2 у ядры, рэпарцёры ARE, накаўт Nrf2), якія дазволілі б зрабіць межы блокаў суцэльнымі.

Калі схема перад вачыма, становяцца бачныя тры крыніцы блытаніны. Па-першае, NRF1 і Nrf2 — розныя бялкі з амаль аднолькавымі назвамі; у даследаванні на мышах вымяралі ядзерны рэспіраторны фактар 1, рэгулятар біягенезу, а не антыаксідантны транскрыпцыйны фактар, і іх атаясамліванне зводзіць усю схему да аднаго вузла. Па-другое, экспрэсія генаў — гэта пачатак гісторыі, а не канец; аднаўленне ўзроўняў інфармацыйнай РНК TFAM або COX1 падтрымлівае меркаванне пра запыт на біягенез, тады як колькасць копій mtDNA і актыўнасць комплексу IV сведчаць, што запыт быў выкананы. Па-трэцяе, антыаксідантны вынік не даказвае ўдзелу шляху Nrf2; зніжэнне ўзроўню акісляльнікаў на 28 працэнтаў у фібрабластах і абарона ад ратэнону ў мышэй — рэальныя наступныя эфекты, але да іх сыходзяцца некалькі шляхоў.

Што дазволіла б зрабіць пункцірны блок суцэльным

Адсутныя эксперыменты — стандартныя. Вымярэнне бялку Nrf2 у ядры пасля ўздзеяння метыленавага сіняга з часовай дынамікай, узгодненай з кароткачасовым сігналам AMPK, дазволіла б праверыць, ці сапраўды абедзве галіны спрацоўваюць разам, як сцвярджае гіпотэза сінхранізаванай актывацыі. Рэпарцёр пад кантролем ARE пацвердзіў бы транскрыпцыйную актыўнасць замест таго, каб выводзіць яе з паводзін генаў-мішэняў. Паўторнае вымярэнне паказчыкаў біягенезу пры накдаўне або накаўце Nrf2 дазволіла б непасрэдна праверыць прычынную стрэлку: калі індукцыя комплексу IV і павелічэнне колькасці mtDNA захоўваюцца без Nrf2, прапанаваная сувязь памылковая, а эфект забяспечвае толькі галіна AMPK. У жывёл даследаванне працяглага ўвядзення з тымі самымі трыма кантрольнымі пунктамі — рэгулятарам, утрыманнем і функцыяй — дазволіла б праверыць, ці застаецца праграма ўключанай, ці адаптуецца. Да таго часу сінхранізаваная актывацыя энергетычных і ахоўных шляхоў застаецца тым, як яе назвалі аўтары: магчымым ключавым фактарам, а не ўсталяваным механізмам.

Чытачам, знаёмым з шырэйшым фармакалагічным кантэкстам, можа спатрэбіцца дадатковая інфармацыя: як метыленавы сіні пераносіць электроны на мітахандрыяльным узроўні, як яшчэ ён уплывае на мітахондрыі і клетачную энергію, якое месца вынікі пра клетачнае старэнне займаюць у даследаваннях старэння, як сцвярджэнні пра біягенез суадносяцца з кагнітыўнымі паказчыкамі і якія даныя пра бяспеку задаюць межы любому абмеркаванню дазавання. Кожнае з гэтых пытанняў — асобнае паняцце са сваёй доказнай базай, і кожнае заслугоўвае такога самага размежавання вымеранага і прапанаванага, якое гэты артыкул прымяніў да Nrf2.