Чаму метыленавы сіні выкарыстоўваюць для кантраснага афарбоўвання кіслотатрывалых бактэрый

Лабарант разглядае мазок макроты пасля поўнай паслядоўнасці афарбоўвання. Чырвоныя палачкі вылучаюцца на сінім полі, і ў заключэнні паведамляюць, што выяўлены кіслотатрывалыя бацылы. На наступны дзень на іншым шкле бачна аднастайнае сіняе поле без чырвоных палачак, і вынік пазначаюць як адмоўны на туберкулёз. Адно з гэтых заключэнняў сцвярджае больш, чым дазваляе прэпарат, і гэта не першае.

Блытаніна мае канцэптуальны характар. Лабарант успрыняў сіні фарбавальнік як частку хімічнага механізму выяўлення, нібыта метыленавы сіні дапамагаў знаходзіць мікабактэрыі. Гэта не так. Да таго моманту, калі метыленавы сіні трапляе на шкло, тэст ужо завершаны. Фарбавальнік толькі афарбоўвае фон, каб вынік можна было прачытаць. У гэтым артыкуле тлумачыцца прызначэнне метыленавага сіняга пры афарбоўванні на кіслотатрываласць, чаму выкарыстоўваюць менавіта сіні, а не іншы колер, і якія высновы дазваляе зрабіць чырвоны колер на сінім фоне.

Кароткі адказ

Афарбоўванне на кіслотатрываласць — гэта дыферэнцыяльны тэст, заснаваны на трох ідэях. Карболавы фуксін, асноўны фарбавальнік, прымусова ўводзяць у кожную клетку, у тым ліку ў мікабактэрыі з воскападобнай абалонкай. Кіслотны спірт, абясколервальнік, выдаляе чырвоны фарбавальнік са звычайных клетак, але не можа выцягнуць яго з кіслотатрывалых. Затым метыленавы сіні, кантрасны фарбавальнік, афарбоўвае ўсё, адкуль абясколервальнік выдаліў фарбу, таму некіслотатрывалыя клеткі, клеткі гаспадара і клетачныя рэшткі выглядаюць сінімі, а кіслотатрывалыя бацылы застаюцца чырвонымі. Кантрасны фарбавальнік забяспечвае кантраст. Ён не ўдзельнічае ў хімічным механізме, які робіць клетку кіслотатрывалай.

Што адбываецца на кожным этапе

Схема ніжэй паказвае размеркаванне роляў. Чытайце яе злева направа як паслядоўнасць працэдуры, а ніжнюю паласу — як напамін пра тое, што кожная група метадаў афарбоўвання адказвае на сваё пытанне.

Спачатку адбываецца пранікненне. Мікабактэрыі ўстойлівыя да звычайных водных фарбавальнікаў, бо іх абалонка незвычайна гідрафобная, таму пратакол прадугледжвае прымусовае пранікненне. У метадзе Цыля — Нельсена награванне да ўтварэння пары прымушае карболавы фуксін, які змяшчае фенол, пранікаць праз воскападобную сценку. У халодным метадзе Кіньюна награванне замяняюць значна больш канцэнтраваным складам асноўнага фарбавальніка, а ў некаторых мадыфікаваных варыянтах без награвання дадаюць павярхоўна-актыўныя рэчывы. У пратаколах афарбоўвання на кіслотатрываласць Амерыканскага таварыства мікрабіялогіі абодва склады прыведзены побач, і розніца ў канцэнтрацыі істотная: прыблізна 0.3 g асноўнага фуксіну на 100 mL для метаду з награваннем супраць каля 4 g для халоднага метаду.

Другім этапам ідзе дыферэнцыяцыя. Кіслотны спірт, звычайна 3 mL канцэнтраванай салянай кіслаты ў 97 mL 95-працэнтнага этанолу, вымывае чырвоны фарбавальнік з кожнай клеткі, сценка якой не аказвае асаблівага супраціўлення. Клеткі з непашкоджанай мікабактэрыяльнай ліпіднай абалонкай утрымліваюць фарбавальнік. Гэта ключавы этап усяго метаду і этап, найбольш адчувальны да тэхнікі выканання, як абмяркоўваецца ніжэй.

Кантраст ствараецца апошнім. Цяпер на шкле ёсць чырвоныя кіслотатрывалыя клеткі на амаль бясколерным фоне клетак, з якіх выдалены фарбавальнік. Метыленавы сіні ў канцэнтрацыі 0.3 працэнта w/v зноў робіць гэты фон бачным, надаючы яму колер, максімальна адрозны ад чырвонага. Кантраснае афарбоўванне кароткае: звычайна ад 20 да 30 секунд у метадзе з награваннем і да некалькіх хвілін у некаторых варыянтах халоднага метаду. Працягласць залежыць ад пратаколу, а не ад уласцівасці самога фарбавальніка.

Чаму гэты фарбавальнік і чаму сіні

Метыленавы сіні — катыённы асноўны фарбавальнік: яго афарбаваны іон нясе дадатны зарад і звязваецца з адмоўна зараджанымі паверхнямі абясколераных бактэрый, клетак гаспадара і клетачных рэшткаў. Падручнік мікрабіялогіі OpenStax апісвае гэтую логіку зарадаў як агульны прынцып дзеяння асноўных фарбавальнікаў. Але метыленавы сіні тут не з'яўляецца хімічна ўнікальным. Крышталёвы фіялетавы і сафранін таксама з'яўляюцца асноўнымі фарбавальнікамі. Выбар абумоўлены оптыкай, а не хіміяй.

Чырвоным палачкам патрэбны фон кантраснага адцення, і сіні процістаіць чырвонаму найбольш карысным для светлапольнай мікраскапіі чынам. Сафранін быў бы дрэнным кантрасным фарбавальнікам, бо яго канчатковы ружова-чырвоны колер занадта блізкі да колеру ўтрыманага карболавага фуксіну, што знішчае самае адрозненне, створанае працэдурай. Крышталёвы фіялетавы даў бы цёмна-фіялетавы фон, які канкурыраваў бы за ўвагу з тонкімі чырвонымі бацыламі. Наймацнейшы доказ таго, што задача заключаецца ў кантрасце, а не ў хіміі, — магчымасць замены: зялёныя кантрасныя фарбавальнікі, такія як малахітавы зялёны і брыльянтавы зялёны, выкарыстоўваюцца ў некаторых ветэрынарных і мадыфікаваных пратаколах, і тэст па-ранейшаму працуе, бо любое выразна адрознае адценне выконвае тую ж ролю.

Адсюль вынікаюць два практычныя высновы. Па-першае, стандартная рэцэптура не прадугледжвае карэкціроўкі pH; не блытайце гэты просты водны 0.3-працэнтны раствор са шчолачнымі складамі, такімі як метыленавы сіні Лёфлера, якія належаць да іншай канцэпцыі афарбоўвання. Па-другое, празмернасць шкодзіць. У літаратуры па гісталогіі асобна папярэджваюць, што празмерна інтэнсіўны сіні фон можа маскіраваць нешматлікія бацылы, таму вытрымліванне фарбавальніка на шкле даўжэй, чым дазваляе пратакол, пагаршае чытальнасць без якой-небудзь карысці.

Хімія сценкі, якая робіць тэст магчымым

Прычына выбарчага дзеяння кіслотнага спірту крыецца ў абалонцы мікабактэрый. Яе структурная аснова — комплекс міколіл-арабінагалактан-пептыдаглікан: пептыдаглікан звязаны з арабінагалактанам, вонкавыя канцы якога нясуць міколавыя кіслоты з вельмі доўгімі ланцугамі, утвараючы багатую ліпідамі вонкавую мікамембрану з незвычайна нізкай пранікальнасцю. У аглядзе вонкавай мембраны мікабактэрый гэтая будова падрабязна апісана. Бар'ер працуе ў абодвух напрамках. Ён перашкаджае пранікненню фарбавальніка, таму для пранікнення патрэбныя награванне або больш канцэнтраваны асноўны фарбавальнік, і перашкаджае выдаленню фарбавальніка, таму кіслотны спірт не можа выдаліць карболавы фуксін, калі той ужо ўнутры. Звычайныя бактэрыі не маюць такой абалонкі і губляюць фарбавальнік. Таму кіслотатрываласць лепш разумець як з'яву, абумоўленую ліпідным бар'ерам, а не як хімічнае звязванне фуксіну з міколавай кіслатой.

Гэтая хімія таксама тлумачыць распаўсюджаную загадку: мікабактэрыі дрэнна і непрадказальна афарбоўваюцца паводле Грама, часам выглядаючы як бледныя формы з пацеркападобнай зярністасцю або неафарбаваныя цені. Іх гідрафобная сценка абмяжоўвае пранікненне крышталёвага фіялетавага. Афарбоўванне на кіслотатрываласць — не мадыфікаванае афарбоўванне паводле Грама. Гэта іншы прынцып дыферэнцыяцыі, заснаваны на іншай уласцівасці сценкі, як паказвае параўнанне простага афарбоўвання і афарбоўвання паводле Грама для двух іншых метадаў.

Тры метады, тры пытанні

Пра шырэйшую групу метадаў афарбоўвання бактэрый адным фарбавальнікам глядзіце атлас афарбоўвання для мікраскапіі.

Чаго не можа даказаць чырвоны колер на сінім фоне

Чырвоныя палачкі азначаюць, што мікраарганізмы ўтрымалі карболавы фуксін пасля ўздзеяння кіслотнага спірту. Такая знаходка адпавядае ўласцівасцям Mycobacterium tuberculosis, але ў рэкамендацыях CDC па дыягностыцы туберкулёзу выразна адзначаецца, што іншыя мікабактэрыі таксама кіслотатрывалыя, таму для ідэнтыфікацыі віду патрэбныя культуральнае даследаванне і даследаванне нуклеінавых кіслот, а не колер.

Памылкі тэхнікі выканання найчасцей звязаны з двума этапамі прамывання. Недастатковае абясколерванне пакідае фонавы матэрыял чырвоным і спрыяе прытворнададатнай інтэрпрэтацыі. Празмернае абясколерванне выдаляе слаба ўтрыманы асноўны фарбавальнік і спрыяе прытворнаадмоўным вынікам. Занадта інтэнсіўнае кантраснае афарбоўванне хавае нешматлікія бацылы ў сінім фоне. Тоўстыя мазкі, асадкі рэагентаў і забруджаная вада для прамывання дадаюць свае артэфакты.

Адчувальнасць абмежавана колькасцю мікраарганізмаў незалежна ад таго, наколькі бездакорна выканана працэдура. Звычайная мікраскапія мазка патрабуе прыблізна ад 5,000 да 10,000 бацыл на мілілітр макроты, а ў ранейшых аглядах доказаў CDC адчувальнасць мазка ацэньвалася прыкладна ў межах ад 45 да 80 працэнтаў сярод выпадкаў лёгачнага туберкулёзу, пацверджаных культуральным даследаваннем. Таму адмоўны мазок ніколі не выключае туберкулёз. Сучасныя рэкамендацыі CDC прадугледжваюць культуральнае даследаванне разам з кожным мазком і рэкамендуюць тэставанне з ампліфікацыяй нуклеінавых кіслот прынамсі аднаго ўзору з дыхальных шляхоў, калі разглядаецца магчымасць лёгачнага туберкулёзу і вынік паўплывае на тактыку вядзення пацыента.

Практычная праца патрабуе зацверджаных пратаколаў

Навучальныя апісанні, у тым ліку гэты артыкул, не даюць дазволу на клінічную працу. Для практычнай лабараторнай працы выконвайце валідзіраваную стандартную аперацыйную працэдуру лабараторыі, узгодненую з актуальнымі дакументамі CDC, APHL або CLSI; даведачны дакумент CDC па афарбоўванні на кіслотатрываласць у архіве Stacks паказвае, як такія працэдуры вызначаюць рэагенты і спосабы ўліку вынікаў. Праца з узорамі для даследавання на туберкулёз патрабуе мер біялагічнай ізаляцыі: мазкі рыхтуюць у шафе біялагічнай бяспекі, бо пры падрыхтоўцы ўтвараюцца аэразолі і пырскі, а рэкамендацыі CDC па лабараторнай бяспецы адзначаюць, што нават мазкі, фіксаваныя награваннем, могуць змяшчаць жыццяздольныя туберкулёзныя бацылы і з імі па-ранейшаму трэба абыходзіцца як з забруджанымі. Запіс у Бібліятэцы выяў грамадскага здароўя CDC пра мазок, афарбаваны карболавым фуксінам і метыленавым сінім і даследаваны на M. leprae, — карысны напамін пра тое, што сфера выкарыстання метаду не абмяжоўваецца туберкулёзам: той жа кантраст чырвонага на сінім служыць усюды, дзе шукаюць кіслотатрывалыя мікраарганізмы, а старанна ўстаноўленая адсутнасць такіх мікраарганізмаў сама па сабе з'яўляецца вынікам, вартым фіксацыі.

Інтэрпрэтацыя гатовага прэпарата

Кантраснае афарбоўванне апраўдвае сябе падчас першаснага прагляду. Мікраскапіст, які праглядае прэпарат пры малым павелічэнні, спачатку выкарыстоўвае сіні фон для ацэнкі якасці мазка: раўнамернасці размеркавання клетак, наяўнасці непашкоджаных клетак гаспадара для факусавання, адсутнасці значнага асадку. Затым увагу прыцягваюць чырвоныя аб'екты, якія могуць быць бацыламі, менавіта таму, што на шкле больш няма нічога чырвонага. Пацвярджэнне адбываецца пры алейнай імерсіі, калі сапраўдныя бацылы маюць чаканы выгляд тонкіх, часам крыху выгнутых палачак або палачак з пацеркападобнай зярністасцю, а не аднастайных часціц фарбавальніка.

Афарбоўванне фону таксама вызначае фармулёўкі заключэння. Для прэпарата з чырвонымі бацыламі паведамляюць, што выяўлены кіслотатрывалыя бацылы, часта з паўколькаснай ацэнкай паводле шкалы лабараторыі. Для прэпарата без чырвоных мікраарганізмаў паведамляюць, што кіслотатрывалыя бацылы не выяўлены, але ніколі не пішуць, што вынік адмоўны на туберкулёз. Гэтае адрозненне важнае, бо сіняе поле сведчыць, што афарбоўванне спрацавала, клеткі ўспрынялі кантрасны фарбавальнік і оптыка была належнай, але нічога не кажа пра мікраарганізмы ў колькасці ніжэйшай за мяжу выяўлення. Сіняе поле без чырвоных аб'ектаў — гэта сапраўдны вынік даследавання прэпарата, а не заключэнне пра пацыента.

Памятайце пра размеркаванне роляў, і правільныя фармулёўкі заключэння стануць відавочнымі. Карболавы фуксін выяўляе магчымыя аб'екты пошуку. Кіслотны спірт праводзіць тэст. Метыленавы сіні толькі робіць адказ чытэльным: чырвоныя аб'екты ўтрымалі фарбавальнік пры ўздзеянні кіслаты, сінія яго страцілі. Усё астатняе — від, колькасць мікраарганізмаў і клінічнае значэнне — высвятляецца даследаваннямі за межамі гэтага прэпарата.