Метыленавы сіні і аўтафагія: AMPK, mTOR і эксперыменты з нейронамі

Уявіце, што вы праводзіце клеткавы эксперымент, дадаяце метыленавы сіні і бачыце, як паласа бялку LC3-II на вашым блотынгу становіцца цямнейшай. Узнікае спакуса абвясціць, што злучэнне «ўзмацняе аўтафагію», і на гэтым спыніцца. Такая інтэрпрэтацыя заўчасная. Цямнейшая паласа LC3-II можа азначаць, што клетка ўтварае больш везікул для ачысткі, а можа — што везікулы назапашваюцца, бо этап утылізацыі заблакаваны. Гэтыя дзве інтэрпрэтацыі паказваюць на супрацьлеглыя працэсы, і ў літаратуры пра метыленавы сіні і нейроны ёсць прыклады доказаў кожнага тыпу. У гэтым артыкуле разбіраецца, што насамрэч вымяралі, метад за метадам.

Макрааўтафагія, форма аўтафагіі, якую тут вывучалі, — гэта сістэма масавай перапрацоўкі ў клетцы. Мембранны мяшочак, які называецца фагафорам, разрастаецца вакол зношаных бялкоў і арганел, замыкаецца ў аўтафагасому, зліваецца з лізасомай, пасля чаго яго змесціва расшчапляецца і вызваляецца для паўторнага выкарыстання. Нейроны залежаць ад гэтага працэсу, бо яны не дзеляцца і не могуць зніжаць долю пашкоджаных кампанентаў праз дзяленне. Калі перапрацоўка спыняецца, адходы назапашваюцца. Калі яна працуе, клетка аднаўляе запас будаўнічых кампанентаў ва ўмовах стрэсу.

Што паказаў адзін эксперымент з клеткамі гіпакампа

У асноўным даследаванні індукцыі выкарыстоўвалі мышыныя клеткі гіпакампа HT22, якія падвяргалі стрэсу, пазбаўляючы сыроваткі на 24 гадзіны. Гэта ўмова прыбірае фактары росту і трафічныя сігналы ды запускае як апаптоз, так і аўтафагію. Даследчыкі паведамілі, што метыленавы сіні зніжаў гібель клетак у залежнасці ад дозы і што гэтая абарона суправаджалася прыкметамі макрааўтафагіі.

Набор маркерных змен быў канкрэтным. Дыфузнае афарбоўванне LC3B пераразмяркоўвалася ў кропкавыя структуры вакол ядра, пачынаючы прыкладна з 20 nM метыленавага сіняга, а найбольш выяўленая рэакцыя LC3-I і LC3-II назіралася каля 1 μM. Узроўні як LC3B-I, так і LC3B-II павышаліся ў залежнасці ад дозы і часу. Важна, што каманда не абмежавалася статычным блотынгам LC3. Даследчыкі дадалі 10 μM хларахіну, які блакуе лізасомнае выдаленне, і выявілі больш высокі ўзровень LC3-II разам са стабілізацыяй p62 у клетках, апрацаваных метыленавым сінім. Такая карціна сведчыць на карысць лізасомазалежнага абароту, а не простага назапашвання. Яны таксама паказалі, што хларахін часткова нівеляваў антыапаптатычны эфект, што звязвае абарону ў гэтай мадэлі з аўтафагічна-лізасомным шляхам.

Вынік, які датычыцца сігналізацыі, часцей за ўсё цытуюць недакладна. Сігналізацыя AMPK, якую ацэньвалі па фасфарыляванай AMPK і яе мішэні ніжэй па сігнальным ланцугу — фасфарыляванай ACC, — узмацнялася праз 12 і 24 гадзіны ў залежнасці ад дозы. Інгібітар AMPK Compound C, які ўжывалі ў канцэнтрацыі 20 μM на працягу апошніх 4 гадзін, зніжаў як фасфарыляванне ACC, так і актывацыю LC3. А вось выяўленага прыгнятання фасфарыляванай mTOR не назіралася. Такім чынам, у клетках гіпакампа пад стрэсам была выяўлена звязаная з AMPK індукцыя праз, відаць, незалежны ад mTOR шлях. Такая ж карціна назіралася ў жывых мышэй, у якіх увядзенне метыленавага сіняга індукавала маркеры макрааўтафагіі ў кары галаўнога мозга і гіпакампе.

Індукцыя — гэта не завершаны паток

Тут асабліва важна адрозніваць паняцці. Індукцыя азначае, што механізмы на пачатковых этапах утвараюць больш аўтафагасом. Паток азначае, што змесціва праходзіць увесь шлях: ізаляцыю, паспяванне, зліццё з лізасомай, расшчапленне і перапрацоўку. Любое павышэнне LC3-II дазваляе гаварыць пра індукцыю, пакуль тэст на паток не пацвердзіць астатнія этапы.

Стандартны тэст на паток вымярае LC3-II з кароткачасовай блакадай лізасом, напрыклад бафіламіцынам A1 або хларахінам, і без яе. Калі ўздзеянне сапраўды паскарае ўтварэнне, блакаванне разбурэння павінна яшчэ больш павысіць LC3-II. Тандэмны рэпарцёр mCherry-GFP-LC3 дае дадатковы ракурс: да зліцця з лізасомай структуры свецяцца жоўтым, а пасля таго, як кіслотнае асяроддзе гасіць сігнал GFP, — толькі чырвоным. Таму большая колькасць выключна чырвоных кропкавых структур сведчыць на карысць пераходу ў кіслыя аўталісасомы. Зніжэнне ўзроўню бялку p62 можа дадаткова пацвердзіць абарот змесціва, але трэба ўлічваць, што транскрыпцыя p62 сама рэагуе на стрэс і яе варта правяраць на ўзроўні мРНК.

Прыведзены ніжэй кантрольны спіс паказвае, што вымярае кожны метад з гэтай літаратуры і чаго ён не можа даказаць сам па сабе. Чытачы могуць выкарыстоўваць яго для ацэнкі любых будучых сцверджанняў пра макрааўтафагію, у тым ліку аргументаў пра галаданне і даўгалецце, якія абапіраюцца на гэтыя маркеры.

Звярніце ўвагу на адну пастку ў фармулёўках, ад якой засцерагае табліца. Фасфарыляваная ACC — гэта форма з прыгнечанай ферментатыўнай актыўнасцю. Павышэнне яе ўзроўню дэманструе вынік сігналізацыі AMPK, а не актывацыю ACC.

Фраза «інгібіраванне макрааўтафагіі ліквідавала нейрапратэкцыю» патрабуе такой жа дакладнасці. У мадэлі HT22 яна азначае, што ўмяшанне ў аўтафагічна-лізасомны шлях ліквідавала перавагу ў выжыванні, якую даваў метыленавы сіні ва ўмовах пазбаўлення сыроваткі. Гэта пацвярджае, што аўтафагія была неабходным або спрыяльным фактарам у гэтай культуры. Але гэта не даказвае, што аўтафагія — адзіны ахоўны механізм злучэння, і не даказвае, што хларахін дзейнічае выключна праз аўтафагію. Каб умацаваць сцверджанне пра прычынную сувязь, спатрэбілася б генетычнае ўмяшанне ў ATG5, ATG7 або ULK1.

Два шляхі да аднаго механізму

Дапамагае спрошчаная схема. Энергетычны стрэс павышае актыўнасць AMPK, AMPK актывуе комплекс ULK1, і аўтафагія пачынаецца. Фактары росту і пажыўныя рэчывы павышаюць актыўнасць mTORC1, mTORC1 інгібіруе ULK1, і аўтафагія застаецца выключанай. Далей па шляху пасля ULK1 комплекс Beclin-1 і VPS34 ініцыюе ўтварэнне фагафора, LC3-I ліпідуецца да LC3-II, аўтафагасома замыкаецца, зліваецца з лізасомай, і змесціва расшчапляецца з абаротам p62.

На схеме кожны вынік для метыленавага сіняга займае сваё месца: вынік з клеткамі гіпакампа — каля галіны AMPK, а вынік з клеткамі-папярэдніцамі — каля галіны mTOR.

Такое тлумачэнне здымае ўяўную неадпаведнасць з другім даследаваннем Xie. У праліферуючых нервовых клетках-папярэдніцах пацука асобны эксперымент выявіў, што 5 μM метыленавага сіняга інгібіравалі праліферацыю і спрыялі стану спакою: колькасць Ki67-станоўчых клетак зніжалася на 1 і 3 дзень, тады як дыферэнцыяцыя клетак, ужо скіраваных на нейронны шлях, захоўвалася. Тут механізм дзейнічаў праз прыгнечаную сігналізацыю mTOR: зніжаліся агульная mTOR і фасфарыляваная mTOR разам з экспрэсіяй p70S6K і 4EBP1, а таксама зніжалася экспрэсія цыклінаў E1, B1, D1 і D2. Дамінантным фенатыпам быў стан спакою клетак-папярэдніц, які аўтары звязвалі з адтэрміноўкай клеткавага старэння, а не з выратаваннем клетак гіпакампа пад стрэсам.

Паміж дзвюма працамі няма супярэчнасці. AMPK і mTOR — інтэгратары, залежныя ад кантэксту, а не пераключальнікі з нязменным дзеяннем. Нейронападобная клетка пад стрэсам можа задзейнічаць AMPK без вымернага інгібіравання mTOR, а клетка-папярэдніца, стымуляваная мітагенамі, можа адказваць на тое самае злучэнне абмежаваннем mTOR-залежнага механізму росту. Тып клеткі, умовы стрэсу, канцэнтрацыя і момант вымярэння вызначаюць, якая галіна дамінуе. Менавіта таму ўплыў метыленавага сіняга на мітахандрыяльную энергетыку і акісляльна-аднаўленчыя працэсы таксама трэба ўключаць у агульную карціну: як апісвае агляд механізмаў нейрапратэкцыі, злучэнне дзейнічае як альтэрнатыўны пераносчык электронаў, задзейнічае антыаксідантную і антыапаптатычную сігналізацыю, інгібіруе MAO і NOS і звязана з абнаўленнем мітахондрый праз біягенез і аўтафагію. Аўтафагія — адна з галін плеятропнага профілю дзеяння, а не ўся карціна.

Чаго эксперыменты не паказваюць

Пазбаўленне сыроваткі мадэлюе трафічны і метабалічны стрэс у культуры. Яно не мадэлюе галаданне цэлага арганізма: глюкоза, амінакіслоты і солі застаюцца ў базавым асяроддзі, а паводзін, звязаных з прыёмам ежы, тут увогуле няма. Канцэнтрацыі ў культуры ад 20 nM да 5 μM нельга арыфметычна пералічыць у дозы для чалавека, бо ўсмоктванне, звязванне з бялкамі, акісляльна-аднаўленчы стан, метабалізм, назапашванне ў тканках і працягласць уздзеяння адрозніваюцца.

Ніводнае даследаванне на людзях не было спланавана для дэманстрацыі аўтафагічнага патоку, індукаванага метыленавым сінім у пацыентаў. Механістычныя доказы па-ранейшаму абмяжоўваюцца клеткавымі даследаваннямі, працамі ex vivo і на жывёлах, а агляды ўсё яшчэ характарызуюць доказы магчымасці пераносу вынікаў у клінічную практыку як папярэднія. Такім чынам, гэтыя даследаванні не паказваюць, што метыленавы сіні ўзнаўляе галаданне, падаўжае жыццё чалавека праз аўтафагію або забяспечвае завершаны аўтафагічны паток у мозгу чалавека. Сцверджанні пра імітацыю галадання і даўгалецце патрабуюць уласных клінічных доказаў, а даследаванні метыленавага сіняга на людзях па іншых паказаннях не становяцца даследаваннямі аўтафагіі толькі праз сувязь з гэтай тэмай. Працы пра мадэлі стрэсу, звязанага з пажыўнымі рэчывамі, і даўгалецця варта чытаць, памятаючы пра гэтую мяжу.

Калі будзеце чытаць наступную працу, паслядоўна ўжывіце кантрольны спіс. Спачатку спытайце, якая галіна змянілася: AMPK, mTOR ці ніводная. Затым спытайце, ці суправаджаўся вынік па LC3 тэстам на паток, ці ён прадстаўлены асобна. Пасля праверце, ці ліквідавала блакаванне шляху карысны эфект і якім метадам гэта зрабілі. Даследаванне, якое адказвае на ўсе тры пытанні, мае падставы для моцнага сцверджання пра механізм. Тое, якое адказвае толькі на першае, паказала дазвольны сігнал, а астатняя частка шляху застаецца нявывучанай.