Метыленавы сіні і дапаможныя клеткі мозгу: астрацыты, мікраглія і запаленне

Уявіце, што вы праводзіце два эксперыменты з адным і тым жа сінім фарбавальнікам і атрымліваеце два абнадзейлівыя вынікі. У адной чашцы зоркападобныя дапаможныя клеткі выжываюць пры недахопе кіслароду і глюкозы. У другой імунныя клеткі мозгу захоўваюць сваю спакойную разгалінаваную форму, нягледзячы на бактэрыяльны таксін. Узнікае спакуса аб’яднаць гэтыя вынікі ў адно сцвярджэнне: фарбавальнік суцішае запаленне ў мозгу і абараняе мозг. Менавіта на гэтым аб’яднанні ўважлівым чытачам варта спыніцца.

У мозгу ёсць дзве папуляцыі дапаможных клетак з рознымі задачамі, і ўздзеянне метыленавага сіняга на кожную з іх вывучаюць з дапамогай розных эксперыментальных трыгераў. Астрацыты — гэта клеткі метабалічнай падтрымкі. Яны размяшчаюцца паміж крывяноснымі сасудамі і нейронамі, выдаляюць лішак глутамату, падтрымліваюць баланс калію, назапашваюць глікаген і перадаюць нейронам энергетычныя субстраты, калі патрэба ў іх рэзка ўзрастае. Мікраглія — гэта пастаянныя імунныя вартавыя. Іх тонкія адросткі абследуюць тканку, выяўляюць бактэрыяльныя сігналы і сігналы пашкоджання, а пры трывозе ўцягваюцца, надаючы клеткам круглявую амёбападобную форму, прыстасаваную для міграцыі і паглынання, з адначасовым выдзяленнем сігнальных малекул. Вынік для адной папуляцыі не пераносіцца на другую, а тое, што менавіта было паказана, вызначаецца вымярэннем, выкарыстаным у кожным выпадку.

Астрацыты ва ўмовах метабалічнага стрэсу: вынік вызначаецца часам

Эксперымент з астрацытамі пачынаецца з дэфіцыту. Даследчыкі культывавалі астрацыты кары галаўнога мозгу нованароджаных мышэй, на шэсць гадзін выдалялі глюкозу і амаль увесь кісларод, а затым аднаўлялі іх паступленне на дваццаць чатыры гадзіны — гэта лабараторная мадэль інсульту з наступнай рэперфузіяй. Калі метыленавы сіні прысутнічаў у фазе дэфіцыту, выжывальнасць клетак пагаршалася. Калі яго дадавалі толькі ў фазе паўторнага насычэння кіслародам, у канцэнтрацыях 0.1 і 1 мікрамоль на літр, выжывальнасць значна паляпшалася паводле аналізу жыццяздольнасці з кальцэінам. Даследаванне астрацытаў мышэй паведамляе пра гэтую розніцу ў залежнасці ад часу разам з данымі клетачнага дыхання.

Гэтая розніца — найважнейшы вынік. Падчас дэфіцыту амаль няма кіслароду, які мог бы прымаць электроны, таму сістэме іх пераносу няма куды іх дастаўляць. Пры паўторным насычэнні кіслародам клетачныя механізмы зноў запускаюцца, і для фарбавальніка з’яўляецца праца. Астрацыты, якія атрымлівалі фарбавальнік, спажывалі больш кіслароду, паглыналі больш глюкозы, выпрацоўвалі больш ATP і аднаўлялі запасы глікагену; актыўнасць гексакіназы была вышэйшай, а ўзровень мітахандрыяльнага супераксіду не павялічваўся. Прапанаванае тлумачэнне ўжо знаёмае з апісання метыленавага сіняга як мітахандрыяльнага пераносчыка электронаў: ён пераносіць электроны ў абыход заблакаваных участкаў дыхальнага ланцуга, каб дыханне аднаўлялася без уцечкі электронаў з утварэннем рэактыўных форм.

Звярніце ўвагу на характар гэтых доказаў. Гэта вынік, які тычыцца выжывальнасці і метабалізму аднаго ізаляванага тыпу клетак, з вызначаным часовым акном эфекту — аднаўленне, а не дэфіцыт — і вызначаным дыяпазонам канцэнтрацый. Ён нічога не кажа ні пра імунную сігналізацыю, ні пра паводзіны.

Мікраглія пры бактэрыяльнай трывозе: перапраграмаванне метабалізму

Эксперыменты з мікрагліяй пачынаюцца з супрацьлеглага трыгера: не галадання, а ілжывага сігналу інфекцыі. Ліпапалісахарыд, фрагмент знешняй мембраны бактэрый, звязваецца з сэнсарамі прыроджанага імунітэту і прымушае мікраглію рэагаваць так, нібы з’явіліся патагены, хоць жывых бактэрый няма. У мышэй, якім уводзілі ліпапалісахарыд, і ў культываванай клетачнай лініі мікрагліі вынікам становіцца знаёмая запаленчая праграма: узрастаюць узроўні празапаленчых фактараў, мікраглія палярызуецца ў бок агрэсіўнага стану M1, суседнія нейроны гінуць, а жывёлы горш выконваюць заданні на навучанне і памяць.

Даследаванне гэтай рэакцыі ў мышэй звязвае яе са шляхам вызначэння ўзроўню кіслароду: ліпапалісахарыд праз папярэдні сігнальны ланцуг Siah2/Morg1 выклікае празмерную экспрэсію PHD3, аднаго з трох ферментаў пралілгідраксілазы. Адначасова клеткі перапраграмоўваюць выкарыстанне энергіі ў бок аэробнага гліколізу з павышэннем узроўню мітахандрыяльных рэактыўных форм кіслароду. Аўтары непасрэдна вымяралі гэты зрух з дапамогай метабалічных аналізаў Seahorse, якія вызначаюць спажыванне кіслароду і пазаклетачнае закісленне. Метыленавы сіні звяртаў назад і метабалічны зрух, і празмерную экспрэсію PHD3, зніжаў узроўні запаленчых фактараў, памяншаў гібель нейронаў і паляпшаў вынікі паводзінных тэстаў. Пазітронна-эмісійная тамаграфія дадала ўзровень візуалізацыі: ліпапалісахарыд павышаў паглынанне глюкозы ў гіпакампе паводле FDG-PET, а ўвядзенне фарбавальніка зноў яго зніжала, што ўзгадняецца з менш актыўным запаленчым метабалізмам у жывым мозгу.

Гэта больш шырокі набор вымярэнняў, чым у даследаванні астрацытаў: цытакіны, метабалізм, візуалізацыя, паводзіны жывёл. Аднак ён тычыцца іншага трыгера і іншых клетак. Чытачам, якія параўноўваюць гэтыя два даследаванні, варта размяжоўваць трыгеры: адно даследаванне паказвае выратаванне дапаможных клетак, якія галадалі, падчас аднаўлення, а другое — прыглушэнне ілжывай інфекцыйнай трывогі ў імунных клетках.

Мікраглія пад мікраскопам: форма як паказчык

Трэці эксперымент разглядае тую ж бактэрыяльную трывогу толькі праз форму клетак. У гліяльных культурах з кары галаўнога мозгу пацукоў кантрольныя клеткі мікрагліі, афарбаваныя на маркер IBA1, маюць шмат тонкіх адросткаў — разгалінаваную форму, характэрную для назірання за навакольнай тканкай. Пасля дваццаці чатырох гадзін уздзеяння ліпапалісахарыду ў канцэнтрацыі 10 мікраграмаў на мілілітр клеткі распластваюцца і набываюць амёбападобную форму, а плошча іх цела павялічваецца, тады як перыметр застаецца прыкладна нязменным — гэта геаметрычная прыкмета акруглення. Метыленавы сіні ў канцэнтрацыі 1 мікрамоль на літр, дададзены разам з таксінам, захоўваў разгалінаваныя адросткі і ўтрымліваў плошчу цела і перыметр клетак блізкімі да кантрольных значэнняў. Даследаванне культуры клетак пацукоў колькасна ацэньвае гэтае захаванне формы праз вымярэнні плошчы і перыметра цела клеткі.

Дзве дэталі робяць гэтае даследаванне больш значным, чым проста выява. Па-першае, менадыён — рэчыва для параўнання, іншая акісляльна-аднаўленча актыўная малекула ў той жа канцэнтрацыі — не захоўваў форму і сам па сабе ссоўваў клеткі да актываванай формы. Таму гэты эфект не з’яўляецца агульнай уласцівасцю ўсіх рэчываў, здольных удзельнічаць у акісляльна-аднаўленчых цыклах. Па-другое, аўтары звязваюць эфект фарбавальніка з актывацыяй Nrf2 — транскрыпцыйнага фактару, які кіруе праграмай антыаксідантных і супрацьзапаленчых генаў, — а не толькі з непасрэдным звязваннем рэактыўных форм. Матэрыялы пра акісляльна-аднаўленчую і запаленчую сігналізацыю дапамагаюць змясціць гэтую сувязь з Nrf2 у кантэкст.

Тым не менш форма — найменш пераканаўчы з трох паказчыкаў. Разгалінаваная клетка звычайна назірае за тканкай, а круглявая звычайна актываваная, але марфалогія — гэта ўскосны паказчык, а не профіль транскрыпцыі. У гэтай культуры не было ні імунных клетак з крыві, ні нейронных контураў, ні паводзінных праяў.

Параўнанне трох вынікаў

Агульная заканамернасць у гэтых радках такая: кожнаму трыгеру адпавядаюць сваё вымярэнне і свой адказ. Аднаўленне метабалізму адказвае на пытанне пра метабалізм. Даныя пра цытакіны і паводзіны адказваюць на пытанне пра запаленне. Форма адказвае на пытанне пра форму. Ніводзін з гэтых трох вынікаў сам па сабе не пераносіцца ў іншую вобласць.

Чаго не даказвае мікраглія, якая выглядае спакайнейшай

Для ўсёй гэтай тэмы патрэбна адна фраза: мікраглія, якая выглядае менш актываванай, або зменены метабалізм мікрагліі самі па сабе не даказваюць паляпшэння функцыі мозгу.

Марфалогія можа змяняцца без адпаведнай змены функцыі. Клетка можа захоўваць адросткі і пры гэтым па-ранейшаму выдзяляць цытакіны або акругляцца, выконваючы карысную працу па выдаленні клетачных рэшткаў. Метабалічныя паказчыкі маюць такое ж абмежаванне: крывая Seahorse або ПЭТ-скан паказваюць выкарыстанне энергіі, а не кагнітыўныя здольнасці. Даследаванне на мышах, якое спалучала метабалічныя і марфалагічныя паказчыкі з паводзіннымі тэстамі, больш пераканаўчае менавіта таму, што аб’ядноўвала ўзроўні доказаў, а не ўскладала ўвесь вывад на адно вымярэнне. Але і тут дзейнічаюць звычайныя абмежаванні: ліпапалісахарыд мадэлюе стэрыльны сігнал трывогі, а не сапраўдную інфекцыю, мышы — не людзі, і самі аўтары адзначаюць міжвідавыя адрозненні. Усім, хто плануе далейшую працу, варта ацаніць, наколькі вынікі даследаванняў мікрагліі пераносяцца паміж мадэлямі, перш чым меркаваць, што гэты шлях дзейнічае гэтак жа ў тканках чалавека.

Адсюль вынікае практычная выснова наконт часу ўвядзення. У даследаванні астрацытаў ранняе ўвядзенне пагаршала вынік, а ўвядзенне падчас аднаўлення яго паляпшала. Вынікі для мікрагліі атрыманы пры ўвядзенні прыблізна ў момант уздзеяння запаленчага трыгера. Пашкоджанне мозгу ў рэальным жыцці адначасова спалучае абедзве фазы: энергетычны збой і імунную трывогу, якія развіваюцца на працягу гадзін. Эксперымент, які ізалюе адну фазу, не можа вызначыць графік увядзення для іх спалучэння. Таму пры абмеркаванні часавых вокнаў увядзення храналогію дэфіцыту і запалення разглядаюць асобна.

Сумленнае падсумаванне змяшчаецца ў адным абзацы. У ізаляваных астрацытах метыленавы сіні, дададзены падчас паўторнага насычэння кіслародам, аднаўляе дыханне і ратуе клеткі. У мікрагліі, на якую ўздзейнічае бактэрыяльны фрагмент, ён звяртае назад запаленчую метабалічную праграму праз пэўны шлях PHD3 і захоўвае форму стану спакою. Кожны вынік сапраўдны ў межах сваіх эксперыментальных умоў, і ніводзін не з’яўляецца агульным вердыктам наконт запалення ў мозгу. Параўнанне гліяльных клетак карыснае менавіта таму, што не дае гэтым дзвюм гісторыям зліцца ў адну.