Метыленавы сіні як індыкатар анаэробных умоў і кіслароду: што даказвае змена колеру

Лабарантка герметычна закрывае анаэробную ёмістасць, правярае праз вечка індыкатарную палоску з метыленавым сінім і бачыць тое, што хоча ўбачыць. Палоска з сіняй стала белай. Яна адзначае ў журнале, што працэс прайшоў у анаэробных умовах, і працягвае працу. Праз два дні на адной чашцы няма росту, а ў герметычна закрытай прабірцы з булёнам у той жа ёмістасці бачныя прыкметы ўздзеяння кіслароду. Палоска паказвала праўду. Лабарантка задала ёй не тое пытанне.

Прычына блытаніны — у змешванні паняццяў. Анаэробны індыкатар з метыленавым сінім звязаны з акісляльна-аднаўленчымі ўмовамі, а не са стэрыльнасцю і не з валідацыяй усёй сістэмы. Калі гэтае адрозненне зразумелае, палоска становіцца дакладным і сумленным інструментам з вузкай задачай.

Асноўны прынцып: зварачальная акісляльна-аднаўленчая пара

Раствораны метыленавы сіні існуе ў двух станах. Акісленая форма — гэта знаёмы сіні катыён. Адноўленая форма, якую называюць лейкаметыленавым сінім, бясколерная. Пры pH, блізкім да нейтральнага, спрошчаная паўрэакцыя выглядае так: адзін сіні катыён разам з адным пратонам і двума электронамі ўтварае адну бясколерную малекулу лейкаформы. Фармальны патэнцыял пры pH 7 складае каля плюс 11 мілівольт адносна стандартнага вадароднага электрода. Гэта дыяпазон, якога могуць дасягнуць многія аднаўляльныя сістэмы і ў якім кісларод можа выклікаць зваротнае ператварэнне.

Для аднаўлення патрэбны нізкі лакальны акісляльна-аднаўленчы патэнцыял. Аднаго выдалення кіслароду не заўсёды дастаткова. Раннія даследаванні анаэробіёзу паказалі, што метыленавы сіні ў звычайнай вадзе без кіслароду захоўваў колер, калі не было аднаўляльнага рэчыва, а сумесі булёну з дэкстрозай і прыкладна 0.01 працэнта фарбавальніка лёгка абясколерваліся пры 37 C. Пры гэтым такая ж сумесь пры 4 C заставалася сіняй на працягу сутак, як паведамлялася ў эксперыментах са свежай тканкай і анаэробнымі ўмовамі культывавання. Тэмпература, pH, глюкоза, аскарбат, тыяглікалят і аднаўляльная актыўнасць мікраарганізмаў вызначаюць, ці даступныя электроны.

Для паўторнага акіслення патрэбны толькі кісларод. Калі паветра дасягае лейкаформы, яна зноў становіцца сіняй. Сучасныя спецыяльна распрацаваныя індыкатары выкарыстоўваюць менавіта гэты цыкл: фарбавальнік разам з аднаўляльнікам і стабілізавальнай матрыцай становіцца бясколерным пры нізкім утрыманні кіслароду і зноў сінім пры кантакце з паветрам. Гэта прадэманстравана ў гібрыдным кіслародным індыкатары з метыленавым сінім на аснове фарбавальніка, аднаўляльніка, паверхнева-актыўнага рэчыва і гліны. У гэтым прататыпе выкарыстоўвалі 0.01 мілімоля на літр фарбавальніка і 2.0 мілімоля на літр аскарбату або глюкозы пры pH 11. Ён станавіўся бясколерным пры ўтрыманні кіслароду каля 0.5 аб’ёмнага працэнта і ў выпрабавальнай камеры дазваляў адрозніваць утрыманне кіслароду ніжэй за 0.1 працэнта ад утрымання вышэй за 0.5 працэнта.

Такім чынам, прынцып працы просты. Сіні колер азначае, што зона індыкатара акісленая. Бясколернасць азначае, што ў зоне індыкатара ўсталяваліся аднаўляльныя ўмовы з нізкім утрыманнем кіслароду. Змена зварачальная, лакальная і хімічная. Сама па сабе яна нічога не кажа пра мікраарганізмы.

Як працуе індыкатарная палоска з метыленавым сінім у анаэробнай ёмістасці

Індыкатарная палоска з метыленавым сінім для анаэробнай ёмістасці — гэта невялікая рэакцыйная зона, размешчаная ў атмасферы ёмістасці так, каб яе можна было бачыць, не адкрываючы сасуд. Камерцыйныя варыянты адрозніваюцца: папяровыя палоскі, таблеткі, якія раствараюць або змочваюць пры падрыхтоўцы, і навейшыя гібрыдныя папяровыя індыкатары. Некаторым для актывацыі рэакцыйнай зоны патрэбна адна кропля дыстыляванай вады. Іншыя выкананы ў сухім фармаце і павінны заставацца сухімі. Кіравацца трэба інструкцыяй да канкрэтнага прадукту, бо ўвільгатненне, размяшчэнне і час счытвання — частка хімічнага працэсу.

На практыцы вынік інтэрпрэтуюць як адзін з двух станаў. Сіні колер азначае, што каля палоскі захоўваецца кісларод або недастаткова аднаўляльныя ўмовы. Белы колер ці бясколернасць азначаюць, што каля палоскі ўсталяваліся анаэробныя акісляльна-аднаўленчыя ўмовы. У некаторыя камерцыйныя папяровыя індыкатары дадаюць чырвоны фонавы пігмент, таму ў адноўленым канчатковым стане яны выглядаюць ружовымі, а не белымі. Перш чым ацэньваць індыкатар, высветліце, які канчатковы стан прадугледжаны для вашага прадукту.

Час залежыць ад сістэмы. У адной сістэме тыпу GasPak абясколерванне пачыналася прыкладна праз гадзіну і завяршалася за некалькі гадзін, а ў кантраляваным параўнальным даследаванні пры пакаёвай тэмпературы метыленаваму сіняму спатрэбілася больш за шэсць гадзін. У гэтай працы акісляльна-аднаўленчы патэнцыял асяроддзя дасягаў прыкладна мінус 100 мілівольт за 60–100 хвілін, задоўга да завяршэння змены колеру фарбавальніка, і быў значна ніжэйшы за мінус 200 мілівольт да таго часу, калі палоска станавілася цалкам бясколернай. Індыкатар рэагуе з затрымкай адносна змен у атмасферы. Сіняя палоска праз адну гадзіну не даказвае няўдачу, а белая палоска праз шэсць гадзін апісвае стан палоскі менавіта праз шэсць гадзін.

З той жа прычыны важнае размяшчэнне. Трымайце палоску ў газавай прасторы ёмістасці, у полі зроку праз вечка, удалечыні ад паверхняў агару і пажыўных асяроддзяў. Яна паказвае стан свайго непасрэднага асяроддзя. Калі пакласці яе ўпрытык да халоднай сценкі, схаваць пад чашкамі або даць кандэнсату прамачыць яе, яна будзе паказваць стан гэтага мікраасяроддзя, а не ёмістасці.

Што паказвае палоска і чаго яна не паказвае

Разглядайце індыкатар з метыленавым сінім у анаэробнай ёмістасці як адзін датчык у адным месцы. Ён пацвярджае лакальныя акісляльна-аднаўленчыя і кіслародныя ўмовы ў сваёй рэакцыйнай зоне. Пры дастатковым перамешванні і ўсталяванні раўнавагі гэтыя ўмовы ў цэлым адлюстроўваюць стан газавай прасторы. Усё астатняе — высновы, для якіх патрэбны асобныя доказы.

Бясколерная палоска не пацвярджае стэрыльнасць. Стэрыльнасць — гэта адсутнасць жыццяздольных арганізмаў, пацверджаная валідаванай стэрылізацыяй і кантрольнымі працэдурамі валідацыі культывавання. Ёмістасць можа быць цалкам анаэробнай і пры гэтым забруджанай або цалкам стэрыльнай і пры гэтым аэробнай.

Яна не забяспечвае валідацыю кожнай часткі сістэмы культывавання. Раствораны кісларод у герметычна закрытай прабірцы, кісларод, затрыманы ў глыбокіх пластах агару, градыенты ў перапоўненай ёмістасці і ўцечка, якая ўзнікае пасля счытвання, застаюцца па-за ўвагай адной палоскі. Эксперыменты з прасторавым размеркаваннем паказалі суседнія сінія і бясколерныя зоны ў адным сасудзе, дзе пранікненне кіслароду і аднаўляльная актыўнасць былі збалансаваныя па-рознаму. Адна кропка не можа пацвердзіць стан усяго аб’ёму.

Яна не даказвае бесперапынны анаэробіёз. Аднаразовае счытванне палоскі пры падрыхтоўцы нічога не кажа пра ўмовы праз дваццаць гадзін. Нядаўнія працы па кантролі якасці анаэробных умоў папярэджваюць, што хімічныя індыкатары апісваюць атмасферу ў момант счытвання і могуць выглядаць здавальняюча, нягледзячы на невялікую рэшткавую колькасць кіслароду. Менавіта бесперапыннае дакументаванне або запісы ў кантрольныя моманты, а не адзін погляд на канчатковы стан, звязваюць паказанні палоскі з інкубацыяй.

Пра хімію, якая ляжыць у аснове змены колеру, глядзіце як метыленавы сіні цыклічна пераходзіць паміж акісленым і адноўленым станамі. Пра шырэйшы ўплыў кіслароду на абыходжанне з узорамі глядзіце матэрыял пра кантроль кіслароду ў мікраскапіі і культываванні.

Схема, якую варта трымаць побач з ёмістасцю

На малюнку ніжэй змест артыкула сабраны ў адну даведачную схему для лабараторнага стала. Тры станы адной і той жа палоскі, два напрамкі рэакцыі і мяжа паміж сведчаннямі індыкатара і валідацыяй сістэмы.

Прычыны збояў, праз якія палоска застаецца сіняй або стварае ілжывую ўпэўненасць

Большасць збояў належыць да пяці груп. Кожная мае характэрныя прыкметы.

Негерметычная ёмістасць або пакет пастаянна прапускае кісларод у рэакцыйную зону. Палоска застаецца сіняй або зноў сінее пасля абясколервання. Перш чым вінаваціць хімію, праверце вечка, пракладку, заціскі і ўшчыльняльныя паверхні.

Вычарпаны або няправільна актываваны газагенератар не выдаляе кісларод. У старых сістэмах з актывацыяй вадой адсутнасць кандэнсату прыкладна праз 10–15 хвілін і адсутнасць награвання вечка прыкладна праз 20–40 хвілін былі раннімі сігналамі праблемы менавіта для такой сістэмы. Пакецік недастатковай ёмістасці ў перагружанай ёмістасці прыводзіць да такога ж выніку.

Атручванне каталізатара датычыцца толькі старых сістэм з вадародам і паладыем, дзе паладый забяспечвае злучэнне вадароду і кіслароду ў ваду. Вільгаць і серавадарод пагаршаюць яго працу. Многія сучасныя пакецікі ўвогуле не выкарыстоўваюць паладый, таму не ўжывайце гэты спосаб выпраўлення там, дзе ён недарэчны.

Палоска, якая страціла ўласцівасці або з якой няправільна абыходзіліся, можа адмовіць без відавочных прыкмет. Падчас захоўвання фарбавальнік і аднаўляльнік губляюць зварачальнасць. Гэта адна з прычын распрацоўкі гібрыдных складаў, устойлівых да выцвітання пад дзеяннем святла і страты ўласцівасцей пры захоўванні. Адбракоўвайце матэрыялы з пратэрмінаваным тэрмінам прыдатнасці або ненармальным пачатковым колерам, а таксама палоскі, якія змочылі, калі яны павінны быць сухімі, або пакінулі сухімі, калі іх трэба змочваць.

Градыент або затрымка ўводзяць у зман назіральніка, а не парушаюць хімічную рэакцыю. Дрэнна перамешаная газавая прастора, герметычна закрытыя прабіркі з раствораным кіслародам і паўцвёрдыя асяроддзі захоўваюць уласныя ўмовы даўжэй, чым можна меркаваць па палосцы. Палоскі з рэзазурынам праходзяць праз ружовы стан да бясколернага і часта пазіцыянуюцца як больш хуткія, але іх парогі залежаць ад уласнага складу і не могуць быць перанесены на метыленавы сіні.

Кантролі і пратакол счытвання, якія варта ўзяць за ўзор

Два недарагія кантролі дапамагаюць выявіць большасць памылак інтэрпрэтацыі. Падчас працэсу трымайце побач свежую кантрольную палоску на пакаёвым паветры. Спраўная палоска з метыленавым сінім там застаецца сіняй. Некаторыя ўпакаваныя індыкатары спачатку бледныя і сінеюць пасля адкрыцця, што само па сабе служыць праверкай працаздольнасці. Таксама перыядычна змяшчайце свежую палоску ў раней валідаваную анаэробную сістэму. Яна павінна дасягнуць валідаванага канчатковага адноўленага стану за час, указаны для прадукту. Калі любы з гэтых кантроляў паводзіць сябе неналежным чынам, замяніце партыю, перш чым давяраць паказанням у ёмістасці.

Пратакол счытвання вынікае з механізму. Размясціце палоску ў газавай прасторы так, каб яе было відаць без адкрыцця ёмістасці, выконваючы інструкцыю да прадукту адносна кантакту са сценкай і змочвання. Запішыце пачатковы колер, час герметычнага закрыцця ёмістасці і колер у кантрольны момант, указаны для прадукту. Калі канструкцыя сасуда дазваляе, фіксуйце, што індыкатар заставаўся адноўленым у вызначаныя кантрольныя моманты падчас інкубацыі. Запішыце канчатковы колер непасрэдна перад адкрыццём. Гэты колер да адкрыцця — канчатковы вынік для дадзенага працэсу. Пасля адкрыцця чакайце паўторнага пасінення і не дазваляйце яму змяняць ацэнку таго, што адбывалася раней.

Калі палоска застаецца сіняй пасля ўказанага часу, лічыце анаэробіёз непацверджаным. Паслядоўна праверце ўвесь ланцужок: герметычнасць, пакецік, каталізатар, калі ён ёсць, увільгатненне і тэрмін прыдатнасці індыкатара, а затым працаздольнасць індыкатара ў параўнанні з кантролем на паветры. Інтэрпрэтаваць наяўнасць або адсутнасць росту можна толькі пасля пацвярджэння стану атмасферы, выкарыстоўваючы сістэму анаэробнага культывавання і кантролі з арганізмамі, якія адпавядаюць канкрэтнай задачы.

У сваёй сферы палоска заслугоўвае апошняга слова. Сіняя ці бясколерная, яна адказвае на адно пытанне пра адно месца ў адзін момант часу. Задавайце ёй гэтае пытанне паводле графіка, з кантролямі побач, і яна будзе адказваць надзейна. Пытайцеся ў яе пра стэрыльнасць, пра кожную прабірку або пра ўсю інкубацыю на падставе аднаго погляду — і ніякая хімія індыкатара не ўратуе такую інтэрпрэтацыю.